蓝细菌PCC6803染色体上毒素—抗毒素基因的研究

论文摘要

毒素—抗毒素系统基因广泛存在于细菌染色体上,它们可被环境胁迫诱导的上调表达蛋白酶所激活,作为原核细胞的胁迫反应因子,参与或介导中度胁迫条件下细胞的生长抑制或死亡。但只有大肠杆菌染色体上的部分毒素—抗毒素系统基因通过试验证明,并且它们的生理功能所知甚少。对大肠杆菌染色体上的mazEF系统研究证明可介导环境胁迫诱导的细胞程序性死亡,但由于毒素—抗毒素系统基因在不同种属细菌的同源性较低或相差很大,该系统确切的生理功能因缺乏充分的试验结果的支持而颇受争议。因此对不同种属细菌染色体上毒素—抗毒素系统基因的功能的研究,对完善细菌细胞程序性死亡理论,揭示细菌适应环境胁迫的分子机制具有重要的理论价值;同时,由于毒素-抗毒素系统中的毒素蛋白对细菌细胞的毒性作用,有学者提出以抗毒性蛋白如MazE为靶标筛选出破坏毒素蛋白和抗毒素蛋白之间相互作用的化合物,使毒性蛋白游离出来从而选择性地杀死目标细菌,为解决临床上抗生素耐药性致病菌的控制问题提供了新思路,具有重要现实意义。本研究以蓝细菌PCC6803为研究对象,对其染色体上可能的毒素-抗毒素系统基因进行研究,主要研究内容包括:1)根据细菌染色体上毒素-抗毒素系统基因的遗传结构特点和保守序列的同源性,利用分子信息学技术系统分析了蓝细菌PCC6803染色体上可能的毒素-抗毒素系统基因;利用本研究构建的双诱导调控启动子的大肠杆菌重组系统,试验鉴定了12对可能的毒素-抗毒素系统基因对大肠杆菌细胞的毒性作用和抗毒性作用;2)根据在大肠杆菌细胞中的分析结果,构建了受铜离子诱导表达的整合性重组系统,利用该系统分析了ssl2920-ssl2921,ssr1114-slr0664和ssr3532-slr2080在PCC6803细胞中的毒性和抗毒性作用;3)构建了ssr3532-slr2080,ssl2920-ssl2921,ssr1114-slr0664基因对缺失的突变株,以及以上各毒素-抗毒素系统基因表达调控质粒,对分析这些系统的表达调控模式具有重要价值。根据上述研究得到以下结果:1)利用本研究构建的双诱导调控启动子的大肠杆菌重组系统,试验分析了12对可能的毒素-抗毒素系统基因中毒素基因对大肠杆菌细胞的毒性作用,其中7个基因诱导表达后对细胞具有显著的毒性作用,7个具有显著的细胞毒性作用基因的上游基因诱导表达后,能抑制毒性基因表达产物的细胞毒性作用。这7对基因包括ssl2920-ssl2921,ssr1114-slr0664,ssr3532-slr2080,ssl2138-sll1092.ssr2962-slr1767,ssl0385-sll0205,ssl1004-sll0525。2)铜离子诱导ssl2921、slr0664和slr2080表达产物对蓝细菌PCC6803具有细胞毒性作用,而铜离子诱导ssl2920-ssl2921,ssr1114-slr0664和ssr3532-slr2080的共表达时,细胞的毒性作用被抑制。根据上述结果ssl2921、slr0664和slr2080为毒素基因,而对应的上游基因ssl2920、ssr1114和ssr3532为抗毒素基因,这3对基因中相邻的两个基因共同构成PCC6803染色体上的毒素-抗毒素系统基因。3)在实验室正常培养条件下,这些基因的缺失并不影响细胞的正常生理功能,这些突变株的构建为确定这些基因的生理功能和表达调控打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 蓝细菌PCC6803概况
• 1.1.1 蓝细菌简介
• 1.1.2 蓝细菌PCC6803的生理、生化特征
• 1.1.3 蓝细菌基因图的制定
• 1.1.4 蓝细菌全基因组测序
• 1.1.5 蓝细菌的遗传系统
• 1.1.6 蓝细菌PCC6803的遗传操作系统
• 1.2 细菌细胞的程序性死亡和"毒素-抗毒素系统"
• 1.2.1 细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）
• 1.2.2 细菌细胞的程序性死亡
• 1.2.3 细菌细胞程序性死亡的机制
• 1.2.4 细菌"毒素-抗毒素系统"
• 1.3 蓝细菌PCC6803基因组中的"毒素-抗毒素系统"
• 1.4 本项研究的目的和内容
• 第二章 蓝细菌PCC6803染色体上毒素-抗毒素基因在大肠杆菌中的克隆和鉴定
• 2.1 材料和方法:
• 2.1.1 菌株及培养条件:
• 2.1.2 分子生物学操作方法
• 2.1.3 PCC6803染色体的提取方法
• 2.1.4 PCR反应体系的建立
• 2.1.5 毒素或抗毒素-毒素基因诱导表达及细胞活性分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 PCC6803染色体上毒素—抗毒素系统基因序列分析
• 2.2.2 双诱导调控启动子质粒的构建
• 2.2.3 PCC6803染色体上毒素基因的扩增、克隆、鉴定
• 2.2.4 含毒素基因重组质粒中克隆片段在E.coli BL21DE3的诱导表达
• 2.2.5 PCC6803染色体上抗毒素基因的扩增、克隆、鉴定
• 2.2.6 含毒素和抗毒素基因重组质粒中克隆片段在E.coli BL21DE3的诱导表达
• 2.2.7 毒素-抗毒素基因诱导表达对细菌生长的影响
• 2.3.讨论:
• 第三章 ssl2920-ssl2921,ssr1114-slr0664,ssr3532-slr2080在蓝细菌PCC6803中的毒性—抗毒性作用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株及培养条件:
• 3.1.2 实验方法:
• 3.1.3 PCC6803的转化
• 3.1.4 诱导表达突变株诱导方法及表型分析
• 3.2 结果:
• 3.2.1 诱导slr0664和ssr1114-slr0664共表达重组质粒的构建
• 3.2.2 诱导slr2080表达和ssr3532-slr2080共表达重组质粒的构建
• 3.2.3 诱导ssl2921表达和ssl2920-ssl2921共表达重组质粒的构建
• 3.2.4 铜离子诱导表达突变株构建
• 3.2.5 铜离子诱导表达突变株细胞活性分析
• 3.3讨论:
• 第四章 ssl2920/ssl2921,ssr1114/slr0664,ssr3532-slr2080缺失突变株和表达调控突变株构建
• 4.1 材料和方法:
• 4.1.1 菌株及培养条件
• 4.1.2 实验方法:
• 4.2 结果
• 4.2.1 ssr1114-sir0664基因的缺失突变重组质粒的构建
• 4.2.2 ssl2920-ssl2921基因的缺失突变重组质粒的构建
• 4.2.3 ssr3532-slr2080基因的缺失突变重组质粒的构建
• 4.2.4 缺失突变株的构建
• 4.2.5 毒素—抗毒素系统基因表达调控质粒的构建
• 4.2.6 毒素—抗毒素系统基因表达调控突变株的构建
• 4.3 讨论
• 第五章 主要结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢