李喆（苏州市中医医院药剂科215000）
【中图分类号】R329.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）31-0095-02
NB4细胞株是急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株。它的生物学特征是在粒系发育的过程中，细胞分化被阻滞在早幼粒细胞阶段。在目前所建白血病细胞株中，NB4是唯一具有APL的特异性t（15；17）与PML/RARα融合基因的APL细胞株，已被作为APL模型应用于分化和分化疗法的研究[1]。
在本室以前的研究中发现，NB4细胞株中pp-GalNAcT-1、T2、T3、T4、T7有表达但表达量不同，pp-GalNAc-T4中等量表达，用ATRA诱导分化细胞后，pp-GalNAc-T4的表达下调。
又有文献报道，在正常白细胞中，只有pp-GalNAc-T1和-T2表达，而-T3、-T4、-T5、-T7的表达未见报道[2,3,4,5,7]。由此可见，后面四种pp-GalNAc-Ts亚型可能只在白血病细胞株中表达。因此，在本研究中，我们希望通过上调pp-GalNAc-T4在NB4白血病细胞中的表达，以研究其在ATRA诱导分化细胞的过程中所发挥的生物学作用。为此，我们构建了pp-GalNAc-T4的正义表达载体，上调白血病细胞NB4中内源性pp-GalNAc-T4的表达.，通过NBT还原实验观察白血病细胞是否向成熟方向分化。
一、材料
1、细胞来源：人急性早幼粒白血病细胞株NB4购自上海生化细胞所。
2、主要试剂
(1)小牛血清购自上海华美生物公司；(2)RPMI1640完全培养基（Gibco，美国）(3)IMDM完全培养基：（Gibco，美国）(4)NBT（硝基蓝四氮唑），sigma公司
3、主要仪器设备
(1)CO2培养箱（HeraesusBB5060）(2)XSZ-D2倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）(3)台式高速冷冻离心机（Eppendorf，西德）(4)紫外透视分析仪Bio-CAPTversion99（VLIBERLOURMAT）
二、方法
1、pcDNA3.1/T4重组质粒转染NB4细胞：(1)G418筛选浓度测定：,筛选浓度，结果为200mg/L。(2)NB4细胞的转染：（按照试剂盒）
2、筛选结果鉴定：（1）RT-PCR分析（2）Westernblot鉴定
3、统计学分析
计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验。利用软件SPSS10.0forWindows。
4、NBT（硝基蓝四氮唑）还原实验：
取500ul新鲜配制含佛波酯（TPA,100ug/ml）10ul的0.2%NBT溶液，分别与等体积细胞悬液混合，37℃温育30min后，光镜下观察，胞浆含蓝灰色颗粒的细胞为阳性细胞，计数200个细胞，得出阳性细胞百分率。
三、结果
（一）ATRA对NB4细胞还原能力的影响：
NB4细胞分化成熟时，糖代谢活跃，代谢中间产物大量释放氢，氢能将无色染料NBT还原沉淀于胞质内，形成蓝黑色颗粒，这种细胞即为NBT还原阳性的细胞，是白血病细胞分化成熟的重要标志。（Table2-8）
用不同浓度的ATRA作用各细胞组72小时后，可以增加NB4和NB4-0细胞的还原率，与对照组比较，有显著差异(P<0.01)。与对照组比较，NB4-T4细胞的还原能力，没有显著差异(P>0.05)。对NB4和NB4-0细胞而言，这两个不同浓度的ATRA，对细胞的还原能力的影响，没有明显的差异（P>0.05）。
Table（2-8）ATRA对NB4细胞NBT还原能力的影响(P<0.01)
四、讨论
pp-GalNAc-T4高表达于胃和结肠，但在小肠、泌尿生殖器官和肺组织低表达[5]。目前已知，在正常白细胞中，只有pp-GalNAc-T1和-T2表达，而-T3、-T4、-T5、-T7的表达未见报道[3,4,5,7]。在本室以前的研究中发现用ATRA诱导分化NB4细胞后，pp-GalNAc-T4的表达下调。由此，我们推测，pp-GalNAc-T4在ATRA诱导分化NB4细胞中可能起负向作用。本研究中，我们希望通过上调pp-GalNAc-T4在白血病细胞NB4中的表达，以研究pp-GalNAc-T4在ATRA诱导分化NB4细胞的过程中所发挥的生物学作用。
因此，我们构建了针对pp-GalNAc-T4的载体，上调白血病细胞NB4中内源性pp-GalNAc-T4的表达，然后，用不同浓度的ATRA处理细胞，观察对细胞NBT还原能力的影响。
NB4细胞分化成熟时，糖代谢活跃，代谢中间产物大量释放氢，氢能将无色染料NBT还原沉淀于胞质内，形成蓝黑色颗粒，这种细胞即为NBT还原阳性的细胞，是白血病细胞分化成熟的重要标志。用不同浓度的ATRA作用各细胞组72小时后，可以增加NB4和NB4-0细胞的还原能力(P<0.01)。但是不能增加NB4-T4细胞的还原能力(P>0.05)。这说明上调表达pp-GalNAc-T4，抑制了ATRA诱导的NB4细胞的分化。
研究表明[8],维甲酸是与维甲酸受体结合而发挥作用的,维甲酸受体在无配体(ATRA)存在时,以RXR/RAR异二聚体的形式与核内广泛存在的核蛋白相互结合成复合物,并与DNA作用而抑制与分化有关的基因的表达,当加入ATRA时,可有效地解离共抑制物从而激活与分化有关基因的表达。全反式维甲酸(ATRA)是临床上已用于治疗早幼粒细胞白血病(APL),并取得较好疗效[9]。但其不良反应限制了临床应用[10]。但ATRA目前应用于临床的治疗剂量毒副反应较大,易导致肝功能异常等不良反应的发生,限制了临床应用[11]。因此,寻找新型高效的分化诱导剂,是肿瘤药物研究的一个重要方向[12]。本实验旨在从糖生物学角度研究白血病的诱导分化，研究糖蛋白与诱导白血病细胞分化的关系，从而为白血病的治疗，提供理论依据。
五、结论
上调pp-GalNAc-T4基因表达后，用不同浓度的ATRA作用各细胞组72小时后，不能增加NB4-T4细胞的还原能力(P>0.05)，但是可以增加NB4和NB4-0细胞的还原能力(P<0.01)。这说明上调表达pp-GalNAc-T4，抑制了ATRA诱导的NB4细胞的NBT还原能力。
参考文献
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[6]BennettEP,HassanH,HollingworthMA,ClausonH.AnovelhumanUDP-N-acetyl-D-galactosamine:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferase,GalNAc-T7,withspecificallyforpartialGalNAc-glycosylatedacceptorsubstrates.FEBSLett460,226-230(1999).
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