分月扇舟蛾4种神经肽的分子特征、表达及作用机制探讨

论文摘要

昆虫的神经肽以神经激素、神经递质和神经调质等形式调节昆虫的生长、发育、变态、生殖等重要环节。对神经肽的分子特征、表达和功能等方面的研究将为揭示昆虫生命过程以及开发基于神经肽的新型农药提供更多的理论基础。本文克隆了分月扇舟蛾的抑咽侧体神经肽（Cloan-AS）、促咽侧体神经肽（Cloan-AT）、滞育激素（Cloan-DH）和性信息素合成激活肽（Cloan-PBAN）的cDNA序列和DNA序列,利用RT-PCR技术检测它们的组织特异性表达及不同发育阶段的相对定量表达情况,对促咽侧体神经肽进行了原核表达的初步研究,并探讨了AS了的作用机制,主要结果如下: Cloan-AS的全长cDNA序列为580bp,编码区372bp,编码124个aa。5’非翻译区从1到111,3’非翻译区从484到580。信号肽切割位点位于第26个aa和第27个aa之间（IHA-AP）。与Spofr-AS、Samcy-AS、Pseun-AS和Drome-AS的相似性分别为83%、77%、83%和42%。 Cloan-AT的全长cDNA序列为790bp,编码区399bp,编码133个aa。5’非翻译区从1到83,3’非翻译区从483到790。信号肽切割位点位于第22aa和23aa之间（AVA-AP）。与Spofr-AT、Helar-AT、Pseun-AT、Mytse-AT、Manse-AT、Samey-AT和Bommo-AT的相似性分别达到92.5%、91.9%、90.4%、89.7%、85.8%、84.4%和80.6%。 Cloan-DH-PBAN的全长cDNA序列为796bp,编码区588bp,编码196个aa。5’非翻译区从1到22,3’非翻译区从611到796。信号肽切割位点位于第20aa和21aa之间（VEA-TN）。Cloan-DH-PBAN的全长cDNA编码DH、PBAN和其它3个SGNP。Cloan-DH与Spoex-DH、Spoli-DH、Agrip-DH、Helar-DH、Samcy-DH、ManseDH、Helze-DH、Helas-DH、Antpe-DH、Helvi-DH、Bomma-DH、Bommo-DH和Adosp-DH的相似性分别为86.2%、81.2%、93.1%、79.3%、79.3%、79.3%、75.9%、75.9%、79.3%、75.9%、75.9%、75.9%和37.9%。Cloan-PBAN与SpoexPBAN、Spoli-PBAN、Agrip-PBAN、Helar-PBAN、Samcy-PBAN、Manse-PBAN、Helze-PBAN、Helas-PBAN、Antpe-PBAN、Helvi-PBAN、Bommo-PBAN、MambrPBAN、Adosp-PBAN和Lymdi-PBAN的相似性分别为90.9%、90.9%、87.9%、93.9%、87.9%、85.7%、93.9%、93.9%、87.9%、91.2%、90.9%、90.9%、63.9%和87.9%。 编码Cloan-AT的DNA序列有814bp,包括2个外显子和1个内含子。编码CloanDH-PBAN的DNA序列有3694bp,包括6个外显子和5个内含子。 利用RT-PCR对Cloan-AS、Cloan-AT和Cloan-DH-PBAN mRNA的组织特异性表达进行了研究,结果表明这三个基因均在头和肠中表达,在体壁中没有检测到。使用半定量RT-PCR分析表明,这三个基因在头中的相对表达水平均是幼虫期和蛹期较低,成虫

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 昆虫神经肽概述
• 1.2 抑咽侧体神经肽
• 1.2.1 AS的分离与基因克隆
• 1.2.2 AS的免疫定位
• 1.2.3 AS的功能
• 1.2.4 AS的作用特点
• 1.3 促咽侧体神经肽
• 1.3.1 已知AT及其结构
• 1.3.2 已克隆的AT基因及其结构
• 1.3.3 AT的合成、贮存、释放和靶器官
• 1.3.4 AT基因组织和发育阶段特异性表达
• 1.3.5 AT的功能
• 1.3.6 AT基因的表达与功能的关系
• 1.3.7 饥饿、交配、寄生对AT表达的影响
• 1.3.8 蜕皮甾体激动剂对Manse-ATmRNA表达的影响
• 1.3.9 Manse-AT与Manse-AS的关系
• 1.4 昆虫的滞育
• 1.5 昆虫的信息素成分
• 1.6 滞育激素和信息素激活肽
• 1.6.1 PBAN和DH的分离鉴定
• 1.6.2 已克隆的DH-PBANcDNA及结构
• 1.6.3 DH-PBAN基因的表达
• 1.6.4 PBAN和DH的免疫组化学分析
• 1.6.5 DH合成、释放、功能
• 1.6.6 DH的靶器官
• 1.6.7 多巴诱导DH-PBAN基因的表达
• 1.6.8 DH-PBAN基因的表达与滞育紧密相关
• 1.6.9 与滞育有关的其它因子
• 1.6.10 PBAN合成、释放、靶器官及功能
• 1.6.11 PBAN在信息素合成途径中的作用位置
• 1.6.12 PBAN受体、第二信使及信号转导
• 1.6.13 PBAN与随雌蛾衰老信息素合成下降的关系
• 1.6.14 交配后信息素滴度变化的原因
• 1.6.15 信息合成的合成不单由PBAN调节
• 1.6.16 影响PBAN活性的其它因子
• 1.7 信息素抑制肽
• 1.8 PBAN结合蛋白
• 1.9 基因克隆的策略
• 1.10 RACE技术原理
• 1.11 构建系统树的方法
• 1.12 分月扇舟蛾简介
• 1.12.1 形态特征
• 1.12.2 生活史及习性
• 1.12.3 危害
• 1.12.4 分月扇舟蛾的神经系统
• 1.13 神经肽类激素的应用前景
• 1.14 本项目研究内容和意义
• 2 分月扇舟蛾4种神经肽基因的克隆、序列分析及表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 所用菌株和质粒
• 2.1.2 昆虫
• 2.1.3 酶、试剂及试剂盒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 技术流程图
• 2.2.2 文中用到的PCR程序
• 2.2.3 DNA的提取
• 2.2.4 以DNA为模板的PCR
• 2.2.5 RNA的提取
• 2.2.6 RNA的质量检测
• 2.2.7 RNA的纯化
• 2.2.8 RNA的反转录
• 2.2.9 AS、AT、DH-PBAN特异性基因片段的PCR反应
• 2.2.10 RACE实验步骤
• 2.2.11 半定量RT-PCR
• 2.2.12 PCR产物的纯化与回收
• 2.2.13 PCR产物的克隆
• 2.2.14 感受态细胞的制备
• 2.2.15 重组质粒转化感受态细胞
• 2.2.16 质粒提取
• 2.2.17 质粒和PCR产物的双酶切
• 2.2.18 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.19 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.20 SDS-PAGE样品的制备
• 2.2.21 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.3 结果
• 2.3.1 分月扇舟蛾基因组DNA的提取
• 2.3.2 分月扇舟蛾总RNA的提取
• 2.3.3 分月扇舟蛾ASC、AT、DH-PBAN基因片段的获得
• 2.3.4 分月扇舟蛾AS、AT、DH-PBANcDNA序列的3’和5’RACE结果
• 2.3.5 分月扇舟蛾AS全长cDNA及序列分析
• 2.3.6 分月扇舟蛾AT全长cDNA及序列分析
• 2.3.7 分月扇舟蛾DH-PBAN全长cDNA及序列分析
• 2.3.8 分月扇舟蛾AT、DH-PBAH基因编码区的DNA序列
• 2.3.9 AS、AT和DH-PBANmRNAs的组织特异性表达
• 2.3.10 AS、AT和DH-PBANmRNAs在头和肠中表达的半定量分析
• 2.3.11 低温与饥饿与AS、AT和DH-PBANmRNAs表达的影响
• 2.3.12 Cloan-AT基因在大肠杆菌中的表达
• 2.4 讨论
• 2.4.1 基因表达半定量方法
• 2.4.2 系统树构建方法的选择
• 2.4.3 进一步研究内容
• 2.5 本章小结
• 3 AS作用机制探讨
• 3.1 AS抑制CA合成JH
• 3.1.1 AS抑制CA合成JH的目标相对性
• 3.1.2 A型AS多个成员之间的协调机制
• 3.1.3 AS与其它肽能物质的相互作用
• 3.1.4 AS在JH合成途径中的作用目标
• 3.2 A型AS对直翅类昆虫生殖的抑制
• 3.3 抑制肌肉收缩
• 3.4 A型AS的信号转导
• 3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 缩写
• 附录B 拉汉昆虫名词
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书