论文摘要
目的:PTEN是近年发现的抑癌基因,其编码的磷酸酶可以拮抗三磷酸酰肌醇激酶途径从而影响细胞的生长。虽然其抗肿瘤作用在很多肿瘤中都已经被证实,但在骨肉瘤中的具体作用目前尚不清楚。本实验采用脂质体法将PTEN导入人骨肉瘤MG-63细胞,观察外源性PTEN基因稳定转染对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响,初步探讨其作用机制。方法:1.人骨肉瘤细胞株MG-63细胞购于中科院上海细胞库;采用CaCl2法将PTEN基因导入大肠杆菌DH5α中扩增,使用柱离心式质粒抽提纯化试剂盒提取质粒;应用阳离子脂质体将PTEN基因转染MG-63细胞,G418筛选出PTEN基因成功转入的阳性细胞克隆,进行培养。2.应用反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）,提取细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo（dT）利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,对PTEN基因在MG-63细胞中mRNA表达进行检测;采用免疫印迹法（Western blot）利用针对PTEN氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测MG-63细胞PTEN基因蛋白的表达3.MTT分析法以活细胞代谢物还原剂P噻唑蓝为基础,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,反映PTEN转染后MG-63细胞活细胞数;将细胞消化成单细胞悬液,接种于24孔培养板,每日取细胞进行计数,将数值转为对数标记在坐标纸上,描绘出生长曲线,观察细胞生长趋势。4.流式细胞术采用FITC—Annexin V、PI双染法,对PTEN转染后MG-63细胞凋亡率进行检测并用流式细胞仪分析转染后细胞周期分布的变化。5.荧光染色法和电镜法对转染后细胞进行形态学观察。结果:1.体外培养出骨肉瘤MG-63细胞,CaCl2法将PTEN基因导入大肠杆菌DH5α中扩增提纯;脂质体法将PTEN基因成功导入细胞中,G418筛选出PTEN基因成功转入的阳性细胞克隆,进行培养。2.反转录-聚合酶链反应法从pCMV-Tag3B-PTEN转染组阳性克隆细胞中扩增出约300 bpPTEN基因片段;免疫印迹法电泳结果显示一条分子量为55KD条带,提示PTEN cDNA在细胞内的整合并成功表达。3.未转染组OD值为0.89±0.03,pcmv-Tag3B组OD值为0.86±0.03,pcmv-Tag3B-PTEN转染组OD值为0.64±0.04。转染组活细胞数明显低于其他两组,有统计学意义（P＜0.01）,提示PTEN对体外培养的人骨肉瘤细胞株细胞增殖具有抑制作用;生长曲线PTEN转染组生长趋势较对照组明显变缓。4.流式细胞术示未转染组凋亡率为3.61±0.39,pcmv-Tag3B组凋亡率为3.90±0.64,转染组凋亡率为22.00±1.53,转染组凋亡率明显高于其他两组,有统计学意义。转染组出现G1期阻滞,提示PTEN至少可以通过对骨肉瘤MG-63细胞进行周期阻滞抑制骨肉瘤细胞生长。5.Hoechst33258荧光染色法显示PTEN转染组大量细胞出现核固缩,染色质高度凝聚可见核裂解和凋亡小体;电镜法观察细胞超微结构,可见转染后细胞细胞体积缩小,出现核固缩,线粒体稀少,核膜突出呈水泡状。结论:1.PTEN重组质粒体外转染骨肉瘤MG-63细胞,可以抑制细胞生长。2.PTEN通过诱导细胞G1期阻滞来抑制骨肉瘤M6-63细胞生长。3.PTEN可能成为骨肉瘤基因治疗新的特异靶点。