黄瓜根围病原菌与拮抗菌的生态学及PGPR诱导抗性机制的研究

论文题目: 黄瓜根围病原菌与拮抗菌的生态学及PGPR诱导抗性机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 梁建根

导师: 张炳欣

关键词: 黄瓜,病原菌,拮抗菌,种群数,根围促生菌,生物防治,细菌鉴定,系统诱导抗性

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 黄瓜（Cucumis sativus L.）是人们喜欢的一种重要蔬菜之一。但由于土传病原引起的病害,不仅影响了黄瓜的产量和品质,而且还造成严重的经济损失。防治方面,生物防治因为克服了化学防治和抗病品种利用等方法所带来的一系列弊端,越来越受到人们重视。植物根围促生细菌（Plant-growth promoting rhizobacteria,简称PGPR）作为最具防病潜力与应用价值的一类有益菌,不仅能够促进植物生长,增加作物的产量,还能提高防病能力。因而成为许多学者研究的热点对象。本文以黄瓜围材料,对其整个生育期的两类重要病原种群动态及其与拮抗菌的相互关系进行了系统研究;采用促生筛选法与抑菌圈筛选法进行了PGPR的筛选,并对筛选到的PGPR进行了鉴定,在此基础上,对PGPR的系统诱导抗性机制作了系统研究,主要的研究结果如下: 1.采用选择培养基法和平板对峙培养法,研究了四个不同黄瓜品种根际两类重要土传植物病原菌（Pythium spp. & Fusarium oxysporum）的种群动态及与其拮抗菌的相互关系研究,结果表明:品种间,同一品种不同生长期间种群数有差异,而且与通常的发病规律相吻合。对各个品种腐霉种群数统计分析表明,品种间差异极显著(F=495.54>F0.01=7.59),尖孢镰刀菌黄瓜专化型种群数统计分析表明,品种间差异极显著(F=2355.57>F0.01=7.59)。整个生育期,所有黄瓜品种抽蔓期腐霉种群数极显著地高于其它时期的腐霉种群数,结主蔓瓜期镰刀菌种群数极显著地高于其它时期的镰刀菌种群数。同时研究了病原菌（Pythium spp. & Fusarium oxysporum）与其拮抗菌的相互关系,相关分析表明,呈较密切的正相关关系,其相关系数分别为0.95和0.81。 2.采用促生筛选法并结合抑菌圈筛选法获得了3株具有促生防病功能的PGPR菌株:CH1、CH2和CH3。通过平皿拮抗、种子催芽生长试验、温室盆栽测定及大田试验的研究。结果表明:筛选获得的3株PGPR促进了黄瓜幼苗的生长,并同时对黄瓜重要土传病原真菌引起的猝倒病与枯萎病有良好的防治效果。 3.对筛选出的PGPR菌株以形态特征、培养性状和生理生化特征观察分析为基础并结合16SrDNA基因全序列分析进行了鉴定。结果表明:两种方法得到的鉴定结果相一致。菌株CH1、CH2和CH3分别鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。 4.促生菌CH1诱导黄瓜抗猝倒病过程中对活性氧清除系统的影响研究结果表明:CH1处理黄瓜幼苗后,显著提高了对猝倒病抗性,从而提高了黄瓜的成苗率。此外,接种病原菌瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）后,黄瓜根部与叶部组织中丙二醛（MDA）、超氧阴离子产生速率（O2-）、H2O2含量明显高于经PGPR CH1处理,同时,CH1处理还明显提高了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）各种保护酶的活性,说明这些酶活性的提高与CH1诱导黄瓜抗猝倒病抗性可能有一定的相关性,并且这种

论文目录:

致谢

摘要

Abstract

第一篇文献综述

第一章植物与微生物的互作和微生物生态研究

1 根系分泌物对微生物的影响

2 微生物对植物的影响

3 引起黄瓜土传病害的重要病原菌及生态研究

3.1 腐霉菌及其生态学研究

3.2 引起黄瓜枯萎病的尖孢子镰刀菌及其生态学研究

4 拮抗菌及其生态学研究

4.1 拮抗菌的种类

4.2 拮抗菌在根围与叶围的定殖

4.3 影响拮抗细菌种群变化的因子

第二章植物病害生物防治的研究概况

第三章植物病害生物防治的研究现状

3.1 生防真菌的开发利用

3.1.1 木霉属真菌

3.1.2 毛壳属真菌

3.1.3 酵母菌

3.1.4 淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及节从菌属真菌

3.1.5 菌根真菌

3.2 生防细菌的开发利用

3.2.1 植物促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)

3.2.2 放射性土壤农杆菌属(Agrobacterium)

3.2.3 巴氏杆菌(Pasteurella)

3.3 放线菌(Actinomycetes)的开发利用

3.4 病原菌无致病力菌株的开发利用

3.5 病毒的弱毒株系

第四章 PGPR的作用机制的研究

4.1 PGPR促进植物生长的机制

4.1.1 植物生长调节作用

4.1.2 促进植物的营养功能来促进植物生长

4.1.3 抑制微效病原菌间接促进植物生长

4.2 PGPR生物防治的机制

4.2.1 抗生作用(Antibiosis)

4.2.2 营养与空间的竞争

4.2.2.1 营养的竞争

4.2.2.2 空间的竞争

4.2.3 重寄生(Parasitism)

4.2.4 诱导系统抗性(ISR)

4.2.5 抗真菌代谢活动

4.2 .6 产生抗真菌酶类

第五章目前生物防治中存在的问题及其对策

5.1 生防菌在植物病害防治中存在的问题

5.1.1 生防菌在田间自然条件下定殖能力差

5.1.2 生防菌的抗药能力差

5.1.3 菌株稳定性问题

5.2 解决生防菌在植物病害防治中存在问题的对策

5.3 展望

第二篇研究报告

第一章黄瓜根际重要病原与其拮抗菌消长规律的研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试黄瓜品种

1.1.2 目标病原菌株

1.1.3 培养基

1.1.4 土样的采集

1.2 研究方法

1.2.1 试验地设计

1.2.2 根际土壤悬浮液制备

1.2.3 病原菌分离、培养和纯化

1.2.3.1 病原菌(Pythium spp.)分离、培养和纯化

1.2.3.2 病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)分离、培养和纯化

1.2.4 拮抗菌筛选、培养和纯化

1.2.5 数据分析方法

2 结果

2.1 不同生育期根围腐霉种群数量变化

2.2 不同生育期根围尖孢镰刀菌种群数量变化

2.3 根围病原菌(Pythium spp.& Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)种群数量与其拮抗菌的相互关系

3 讨论

第二章黄瓜PGPR的分离筛选及对黄瓜苗期病害生物防治的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样的采集

1.1.2 供试黄瓜品种

1.1.3 目标病原菌株

1.1.4 培养基

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜根围细菌的分离

1.2.2 PGPR菌株筛选

1.2.2.1 促生筛选法：

1.2.2.2 抑菌圈筛选法：

1.2.2.3 PGPR筛选菌株用于田间试验

2 结果与分析

2.1 根围细菌的分离

2.2 PGPR菌株的筛选

2.2.1促生筛选法:

2.2.2 PGPR筛选菌株生防效果的田间试验

3 讨论

3.1 关于生防细菌的筛选

3.2 PGPR与植物病害生物防治

第三章 PGPR菌株的分类鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 试剂

1.1.3 引物合成

1.2 方法

1.2.1 菌株CH1、CH2和CH3形态特征观察和生理生化指标(Buchanan et al.,1984；方中达，1998)测定。

1.2.1.1 格兰氏染色

1.2.1.2 鞭毛的观察

1.2.1.3 荧光色素观察

1.2.1.4 芽孢染色

1.2.1.5 氧化酶反应

1.2.1.6 接触酶反应

1.2.1.7 好氧性和厌氧性

1.2.1.8 碳水化合物发酵

1.2.1.9 淀粉水解

1.2.1.10 精氨酸双水解

1.2.1.11 明胶液化

1.2.1.12 V-P测定

1.2.1.13 7％NaCl耐盐生长

1.2.1.14 反硝化

1.2.1.15 柠檬酸盐的利用

1.2.1.16 丙二酸盐的利用

1.2.2 菌株CH1和CH2基因组DNA的提取(Sambrook et al，2002)

1.2.3 16S rDNA基因序列的克隆

1.2.4 PCR产物的纯化与回收(参照产品说明书)

1.2.5 克隆与筛选

1.2.5.1 16S rDNA基因片段与克隆质粒pGEM-T Vector连接(参照产品说明书)

1.2.5.2 感受态细胞的制备(Sambrook et al，2002)

1.2.5.3 连接产物的转化(Sambrook et al，2002)

1.2.5.4 碱裂解法少量提取质粒(Sambrook et al，2002)

1.2.5.5 酶切鉴定阳性克隆

1.2.5.6 16S rDNA序列测定及分析

2.结果

2.1 形态学特征

2.2 部分生理生化特征

2.3 菌株CH1和CH2的16S rDNA序列扩增及阳性克隆的鉴定

2.4 16S rDNA序列测定及分析

3 讨论

第四章促生菌CH1诱导黄瓜抗猝倒病过程中对活性氧清除系统的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料与接种处理

1.1.1 供试品种

1.1.2 供试菌株

1.1.3 病原菌接种体的制备

1.1.4 CH1细菌悬浮液的制备

1.1.5 黄瓜植株的准备

1.1.6 分根试验

1.1.7 接种处理

1.1.8 CH1诱导接种

1.1.9 病原菌挑战接种

1.2 实验方法

1.2.1 丙二醛(MDA)含量测定

1.2.2 超氧阴离子产生速率测定

1.2.3 H_2O_2含量测定

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)测定

1.2.5 过氧化物酶(POD)测定

1.2.6 过氧化氢酶(CAT)测定

2 结果与分析

2.1 促生菌CH1处理黄瓜对猝倒病的诱抗效果

2.2 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部MDA活性的变化

2.3 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部超氧阴离子产生速率的变化

2.4 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部H_2O_2含量的变化

2.5 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部SOD活性的变化

2.6 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部POD活性的变化

2.7 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部CAT活性的变化

3 讨论

第五章促生菌诱导黄瓜对猝倒病的抗性时对黄瓜幼苗生长及品质和影响

1 材料与方法

1.1 供试材料与接种处理

1.1.1 供试品种

1.1.2 供试菌株

1.1.3 CH1细菌悬浮液的制备

1.1.4 黄瓜植株的准备

1.2 实验方法

1.2.1 促芽测定

1.2.2 生长测定

1.2.3 生理指标测定

1.2.3.1 超氧阴离子产生速率测定

1.2.3.2 H_2O_2含量测定

1.2.3.3 丙二醛(MDA)含量测定

1.2.3.4 叶片叶绿素含量

1.2.3.5 蛋白质含量测定

1.2.3.6 可溶性糖含量测定

1.2.3.7 Vc含量测定

2 结果与分析

2.1 促芽生长平皿试验

2.2 植物促生菌CH1对黄瓜生长的影响

2.3 植物促生菌CH1与CH2对黄瓜幼苗组织中叶绿素、蛋白质、可溶性糖和Vc含量的影响

2.4 植物促生菌CH1与CH2对黄瓜幼苗组织中超氧阴离子产生速率、H_2O_2和丙二醛(MDA)含量的影响

3 讨论

第六章促生菌对黄瓜酚类物质代谢的影响及与抗猝倒病的关系

1 材料与方法

1.1 材料及处理

1.1.1 供试品种

1.1.2 供试菌株

1.2 试验处理

1.3 测定方法

1.3.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)测定

1.3.2 多酚氧化酶(PPO)测定

1.3.3 阿魏酸的测定

1.3.4 绿原酸的测定

1.3.5 木质素含量测定

1.3.6 酚类物质含量的测定

1.3.7 类黄酮含量测定

2 结果与分析

2.1 硅处理对黄瓜叶片PAL活性的影响

2.2 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部PPO活性的变化

2.3 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部阿魏酸含量的变化

2.4 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部绿原酸含量的变化

2.5 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部木质素含量的变化

2.6 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部总酚含量的变化

2.7 CH1处理后黄瓜幼苗根部与叶部类黄酮含量的变化

3 讨论

第七章根围促生菌CH1诱导黄瓜抗炭疽病的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试黄瓜品种

1.1.2 诱导菌株

1.1.3 挑战病原菌株

1.2 方法

1.2.1 诱导物细菌悬浮液的制备

1.2.2 病菌培养

1.2.3 黄瓜植株的准备

1.2.4 诱导处理

1.2.5 挑战接菌

1.2.6 PGPR菌株CH1对黄瓜炭疽病菌的平板测定

1.2.7 不同PGPR菌株对黄瓜炭疽病的诱导

1.2.8 促生菌CH1不同处理方法对诱导黄瓜抗炭疽病的影响

1.2.9 促生菌诱处理后抗炭疽病的持效期的测定

1.2.10 几丁质酶活性测定

1.2.11 β-1，3-葡聚糖酶活性变化

2 结果与分析

2.1 PGPR菌株CH1对黄瓜炭疽病菌的平板测定

2.2 不同PGPR菌株对黄瓜炭疽病的诱导

2.3 促生菌CH1不同处理方法对诱导黄瓜抗炭疽病的影响

2.4 促生菌CH1诱导黄瓜抗炭疽病持效期的测定

2.5 CH1处理后接种炭疽病菌的黄瓜根部与叶部中几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性变化

3 讨论

参考文献

全文小结

附录A 主要培养基

附录B 主要溶液与试剂

附录C 菌株CH1和CH216S rDNA序列的Blast结果

发布时间: 2005-07-22

黄瓜根围病原菌与拮抗菌的生态学及PGPR诱导抗性机制的研究

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