论文摘要
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand, GITRL）是肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily, TNFSF）中的第18个成员,主要在树突状细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞及骨髓基质细胞中表达,属于Ⅱ型跨膜蛋白。新近的一项研究显示,它抑制由RANK介导的外周血单个核细胞向破骨细胞的分化,具有调节骨代谢的作用,因此称之为Osteostat。目前,对它调节破骨细胞分化的机制还知之甚少。Osteostat蛋白分为胞内段、胞外段和跨膜区三个部分,胞外段含有C-类凝集素的基序。基于此,我们采用基因工程的方法,在大肠杆菌中表达Osteostat胞外段重组蛋白,并应用报告基因技术检测其生物活性。本文根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性和密码子的简并性原则,在不改变氨基酸序列的条件下,将Osteostat的胞外段密码子全部替换成大肠杆菌偏嗜的密码子。利用重组PCR技术获得大肠杆菌偏嗜性Osteostat的胞外段DNA序列。先将其克隆入pTA2中,经测序正确后,再将其插入原核表达载体pQE-30Xa,获得成功构建的重组表达载体pQE/Osteostat。重组表达载体转化E.coli M15[pREP4]进行诱导表达。在37℃、0.5 mM IPTG诱导表达4小时条件下,将诱导表达菌制备细胞抽提物,可溶部分和沉淀部分分别行SDS-PAGE,观察到细胞裂解物沉淀在预期分子量位置有明显的蛋白表达条带。免疫印记Western-blotting显示预期位置蛋白可与抗His抗体发生免疫识别,证明此重组蛋白确系His-Osteostat重组融合蛋白。改变表达目的蛋白的温度、时间和诱导剂的浓度,优化目的蛋白表达的条件,获得最适的表达条件：表达温度37℃,加入诱导剂IPTG后表达时间6小时,诱导剂IPTG的使用浓度为0.5 mM。目的蛋白含6×His纯化标签,可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,冲洗除去非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,获得目的蛋白的初级纯品。通过透析的方法除去洗脱液中的咪唑、尿素和一些盐离子。利用BCA法测得透析液总蛋白浓度,并将透析液行SDS-PAGE还原凝胶电泳,UVP凝胶分析系统分析纯化后融合蛋白的纯度。GITRL的受体为GITR （glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor）,也叫做糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体,是肿瘤坏死因子受体超家族成员。大量研究表明,GITRL/GITR具有许多生物学活性,包括细胞的增殖、分化和存活等。国外一项研究显示：GITRL/GITR配受体结合可以激活NF-K B信号转导通路。基于这样的发现,我们通过报告基因技术检测重组Osteostat胞外段蛋白的生物学活性。首先,构建人GITR编码基因的表达载体,建立稳定表达GITR基因的HEK293细胞株。然后,用包含NF-κB增强子序列的报告基因载体（luc/NF-κB）转染该细胞株,建立用于重组Osteostat胞外段蛋白活性分析的细胞模型。将各种浓度的重组His-Osteostat干预该细胞模型24或36小时,采用荧光素酶（luciferas, luc）活性测定试剂盒检测,发现各种浓度的重组His-Osteostat蛋白均较溶媒组显著提高报告基因荧光素酶的化学发光值,说明His-Osteostat重组融合蛋白具有生物活性。