龙眼胚胎乙醇脱氢酶的分离纯化、鉴定及其cDNA克隆

论文摘要

在龙眼离体胚胎发生中发现存在某种类型的脱氢酶，初步的研究显示该组蛋白质可能是NAD依赖型的类糖醇脱氢酶。比较了该类糖醇脱氢酶在龙眼离体胚胎发生过程中的变化，发现随着胚发育进程，其活性逐步降低；同工酶电泳显示，虽然其酶谱各谱带均出现于胚性愈伤组织、球形胚和子叶胚中，但随着胚的发育其染色强度不断降低，显示龙眼离体培养材料存在的该组酶与其离体胚的发生、发育有关。为了明确该组类糖醇脱氢酶的属性，以揭示其在龙眼胚胎发生、发育过程中的生理作用，本试验进行了该酶的分离、纯化、生物质谱鉴定及其cDNA克隆。主要研究结果如下： 1．龙眼胚性愈伤组织类糖醇脱氢酶的分离纯化。采用低浓度的DTT以及加入10％的甘油有利于该组类糖醇脱氢酶在体外溶液环境的稳定。在此基础上，通过研究其在不同层析分离介质中的分离特性，建立了适用于该组类糖醇脱氢酶的分离纯化体系。经过80％饱和度的（NH4）2SO4盐析、Sephadex G-25柱脱盐，然后经过DEAE-Sepharose F．F．、DEAE-52、Phenyl Sepharose和Superdex 200柱层析，从龙眼胚性愈伤组织中分离纯化得到类糖醇脱氢酶的2个同工酶组分Lc．A和Lc．B。比较非变性PAGE和SDS-PAGE的结果，显示Lc．A和Lc．B均为同型二体蛋白，其亚基的表观分子量大小相同，为47.4kD。Lc．A和Lc．B具不同的等电点。 2．龙眼胚性愈伤组织类糖醇脱氢酶的生物质谱鉴定。应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行肽质量指纹分析，显示Lc．A和Lc．B均能较好地与其他植物的乙醇脱氢酶（ADH）相匹配。应用电喷雾解离—四极杆—飞行时间串连质谱（ESI-Q-TOF2）技术解析了Lc．B的4个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别是：GTFFGNYKPR、KFGVTEFVNPK、AFEYMLGGDGR和FITHEVPFSEINK；解析了Lc．A的4个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别是：FGVTEFVNPK、GTFFGNYKPR、FITHEVPFSEINK和DYDKPVQEVIAEMTDGGVDR（或者DYDKPVKEV LAEMTDNVDR）。数据库检索和序列比对分析均表明Lc．A和Lc．B均显著匹配于ADH。因此，在肽质量指纹的基础上，鉴定从龙眼胚性愈伤组织中纯化得到的类糖醇脱氢酶Lc．A和Lc．B分别为ADH同工酶的2个组分。 3．龙眼离体胚胎发生、发育过程中ADH的活性变化测定。试验发现，从胚性愈伤组织至球形胚和子叶胚阶段，ADH的活性呈下降趋势，同工酶谱分析进一步显示了相同的结果，表明高ADH活性可能与龙眼的体胚早期发生或与维持愈伤组织的高再生能力有关。 4．龙眼胚性愈伤组织ADH cDNA克隆。采用同源克隆的方法获得了龙眼ADHcDNA的保守片段，并在此基础上，通过3′和5′-RACE，获得了龙眼ADH的cDNA全序列，该序列与其他植物ADH cDNA有很高的同源性。该cDNA全长1386bp，

论文目录

• 独创性声明
• 论文使用授权的说明
• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 引言
• 1 植物乙醇脱氢酶（ADH）的功能及其基因表达调控
• 1.1 ADH与胚（种子）发育的关系
• 1.2 ADH与种子萌发
• 1.3 ADH与植物的离体再生
• 1.4 ADH与果实的生长发育
• 1.5 ADH与花粉发育、萌发
• 1.6 乙醇脱氢酶基因在逆境条件下的诱导表达调控
• 1.6.1 Adh基因的启动子反应元件及其诱导表达的信号转导机制
• 1.6.2 Adh基因的组织、时空特异表达
• 2 ADH酶蛋白的分离纯化及其生化特性研究
• 3 本研究的目的、内容和技术路线
• 第一章 龙眼离体胚中类糖醇脱氢酶分离纯化方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 材料
• 1.3 类糖醇脱氢酶的提取、盐析和柱层析分离
• 1.3.1 蛋白质的提取与盐析
• 1.3.2 蛋白质样品过柱除盐
• 1.3.3 DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离
• 1.3.4 DEAE-52柱层析分离
• 1.3.5 Phenyl Sepharose High Performance柱层析分离
• 1.3.6 Q-Sepharose High Performance柱层析分离
• 1.3.7 Superdex 200 prep grade柱层析分离
• 1.3.8 类糖醇脱氢酶在层析柱后活性的检测
• 1.4 蛋白质样品的电泳及检测
• 1.4.1 蛋白质样品的电泳分离
• 1.4.2 电泳后的检测
• 2 结果和分析
• 2.1 龙眼EC中类糖醇脱氢酶的生化反应特性
• 2.1.1 不同pH、不同辅酶对龙眼EC中类糖醇脱氢酶染色强度（活性）的影响
• 2.1.2 不同的染料对染色强度（活性）的影响
• 2.2 类糖醇脱氢酶在龙眼体胚发生不同阶段的表达变化
• 2.3 类糖醇脱氢酶在柱层析分离后的活性丧失及其稳定
• 2.3.1 DTT浓度对酶活性的影响
• 2.3.2 酶在层析分离后的活性丧失及其稳定
• 2.4 龙眼类糖醇脱氢酶分离纯化策略的探索建立
• 2.4.1 龙眼类糖醇脱氢酶的初步纯化
• 2.4.2 龙眼类糖醇脱氢酶分离纯化体系的进一步优化
• 3 小结与讨论
• 3.1 类糖醇脱氢酶的分子特性
• 3.2 龙眼EC中类糖醇脱氢酶在体外的稳定
• 3.3 龙眼EC中无底物依赖型脱氢酶在不同分离介质中的分离特性
• 3.4 龙眼EC中类糖醇脱氢酶分离纯化顺序
• 第二章 龙眼类糖醇脱氢酶Lc.A和Lc.B的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 蛋白的提取、盐析和脱盐
• 1.2 DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离
• 1.3 DEAE-52柱层析分离
• 1.4 Phenyl Sepharose柱层析分离
• 1.5 Superdex 200柱层析分离
• 1.6 离心超滤浓缩
• 1.7 酶活性的检测
• 1.8 蛋白质电泳检测
• 1.8.1 常规非变性PAGE
• 1.8.2 非变性梯度胶PAGE
• 1.8.3 SDS-PAGE
• 1.8.4 电泳后的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 Lc.A和Lc.B的DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离
• 2.2 Lc.A和Lc.B的DEAE-52柱层析分离
• 2.3 Lc.A和Lc.B的Phenyl Sepharose柱层析分离
• 2.4 Lc.A和Lc.B的Superdex 200柱层析
• 3 小结与讨论
• 第三章 Lc.A和Lc.B的质谱鉴定及其在龙眼体胚发生中活性变化的再证实
• 1 Lc.A和Lc.B的肽质量指纹分析、串连质谱测序和蛋白质鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 样品的SDS-PAGE
• 1.1.2 蛋白质（肽）的原位酶解
• 1.1.3 肽段的提取
• 1.1.4 MALDI-TOF质谱分析
• 1.1.5 ESI-Q-TOF2串联质谱测序
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 Lc.A和Lc.B的MALDI-TOF分析
• 1.2.2 Lc.B的Q-TOF2分析及蛋白质鉴定
• 1.2.3 Lc.A的Q-TOF2分析及蛋白质鉴定
• 1.2.4 Lc.B和Lc.A串联质谱得到的肽段与已知序列的多重对齐分析
• 2 龙眼体胚发生过程中乙醇脱氢酶活性的变化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 Lc.A和Lc.B是ADH同工酶的两个组分
• 3.2 Lc.A和Lc.B与已知的ADH的氨基酸序列具很高的同源性
• 3.3 ADH可能与龙眼早期的离体胚发生或维持其愈伤组织的高再生能力有关
• 3.4 Lc.A和Lc.B的N-末端可能为乙酰化封闭
• 3.5 龙眼中的乙醇脱氢酶Lc.A和Lc.B的生化特性
• 第四章 龙眼胚性愈伤组织ADH cDNA的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 龙眼总RNA的提取
• 1.2.1 EC总RNA的提取
• 1.2.2 合子胚总RNA的提取
• 1.3 EC中ADH cDNA保守区的克隆
• 1.3.1 cDNA的合成
• 1.3.3 PCR产物的回收纯化
• 1.3.4 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.3.5 质粒的提取与测序
• 1.4 EC中ADH cDNA的3'-RACE
• 1.4.1 cDNA的合成
• 1.4.2 3'-RACE
• 1.4.3 PCR产物的回收纯化
• 1.4.4 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.5 EC中ADH的5'-RACE
• 1.5.1 RNA的逆转录
• 1.5.2 柱纯化cDNA第一链合成产物
• 1.5.3 cDNA第一链3'端加尾
• 1.5.4 柱纯化cDNA第一链3'端加尾产物
• 1.5.5 cDNA第二链的合成
• 1.5.6 PCR扩增反应
• 1.5.7 PCR产物的回收纯化
• 1.5.8 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.6 ADH cDNA在大肠杆菌中的表达
• 1.6.1 ADH cDNA全开放阅读框的克隆
• 1.6.2 p15-ADH转化至大肠杆菌表达宿主及诱导表达
• 2 结果和分析
• 2.1 龙眼EC中抽提的总RNA的质量
• 2.2 ADH cDNA保守区的克隆
• 2.3 ADH cDNA的3'-RACE
• 2.4 ADH cDNA的5'-RACE
• 2.5 龙眼EC中ADH cDNA全长及其序列分析
• 2.6 Adh基因在龙眼合子胚发育过程中的表达
• 2.7 Lc.A和Lc.B的肽指纹数据与cDNA理论翻译产物的氨基酸序列比对
• 2.8 龙眼EC中ADH cDNA在E.coli的表达
• 2.8.1 龙眼EC中ADH的cDNA开放阅读框的扩增及插入表达载体pET-15b
• 2.8.2 龙眼EC中ADH在大肠杆菌BL21中的表达
• 3 小结与讨论
• 3.1 首次从龙眼克隆得到ADH的cDNA
• 3.2 龙眼合子胚中Adh基因的表达
• 3.3 ADH的原核表达
• 总结
• 参考文献
• 附录（Ⅰ）
• 附录（Ⅱ）
• 附录（Ⅲ）
• 致谢
• 在学期间发表的相关论文