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猫干扰素FeIFN-ω和FeIFN-α的克隆、表达和体外生物学活性研究

2020-12-02阅读(161)

猫干扰素FeIFN-ω和FeIFN-α的克隆、表达和体外生物学活性研究

论文摘要

猫干扰素omega（FeIFN-ω）属Ⅰ型干扰素,具有抗病毒,抗增殖和免疫调节功能。干扰素的生物学活性具有种属限制性,但也有报道,人IFN-ω对其他种属也有作用,而且较之IFN-α具有更为广谱的生物学活性和更高的抗病毒能力。干扰素的研究已有几十年的历史,但对猫源干扰素的研究,目前国内尚未见报道。1.本试验从感染猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的普通缅甸猫脾脏中克隆猫ω型干扰素基因（FeIFN-ω）;以实验室保存的含猫α型干扰素基因（FeIFN-α）的质粒Pet-28a/FeIFN-α为模板,PCR扩增FeIFN-α成熟区域。利用分子生物学技术,分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,得到高效稳定的包涵体表达。通过包涵体洗涤和Ni-NTA亲和层析两步纯化,蛋白纯度能达到95%以上。2.本研究采用以细胞致病效应（CPE）抑制为基础的抑制微量测定法,根据结晶紫染色,利用酶标仪测定干扰素的抗病毒活性结果。试验从两个方面比较了干扰素FeIFN-ω、FeIFN-α的体外生物学活性,同时以日本干扰素产品Intercat?作为参照。第一,从干扰素广谱抗病毒活性方面,比较了三种干扰素亚型抵抗四种不同种属病毒的活性;第二,从干扰素生物学活性的种属限制性方面,比较了三种干扰素亚型在五种不同种属细胞上,抵抗水泡性口炎病毒的活性。结果显示,第一,重组猫ω型干扰素（FeIFN-ω）抵抗四种病毒的活性明显高于重组猫α型干扰素（FeIFN-α）,尤其对H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒（CDV）,FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat?对CDV和AIV均未表现活性。第二,FeIFN-ω在五种不同种属的细胞上均显示高效的抗病毒活性,在非洲绿猿猴肾细胞（VERO）和牛肾细胞（MDBK）上,FeIFN-ω抗VSV的活性能达到0.13×106U/mg,是FeIFN-α活性的15～30倍。在人宫颈癌细胞（HeLa）和猪肾细胞（PK-15）上,FeIFN-ω的抗病毒活性达到5×104U/mg,是FeIFN-α的100倍。而Intercat?只在猫肾细胞（CRFK）上表现抗病毒活性,在其他种属细胞系上均无活性。本研究这为下一步的临床研究提供了重要的理论依据,为寻求新的有效的动物抗病毒药物,构建高效的基因工程干扰素制品提供了理论依据和研究手段。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 1、前言
  • 1.1 干扰素研究背景
  • 1.1.1 概述
  • 1.1.2 干扰素的分类及来源
  • 1.1.3 干扰素的分子结构
  • 1.2 干扰素的抗病毒活性及其研究进展
  • 1.2.1 干扰素的抗病毒活性作用机理
  • 1.2.2 干扰素的抗病毒活性研究进展
  • 1.3 ω型干扰素研究进展
  • 1.4 研究的目的、意义和创新点
  • 2、猫干扰素FeIFN-ω与FeIFN-α的克隆、表达、纯化及复性方法研究
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 动物组织
  • 2.1.2 菌种和质粒
  • 2.1.3 酶和试剂
  • 2.1.4 实验所用溶液及其配制
  • 2.1.5 主要仪器设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 重组质粒pMD-18T/FeIFN-α和pMD-18T/FeIFN-ω的构建及鉴定
  • 2.2.2 原核表达质粒pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω的构建及鉴定
  • 2.2.3 重组质粒pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α转化感受态细胞
  • 2.2.4 重组质粒pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α的诱导表达
  • 2.2.5 表达产物的纯化、复性及蛋白浓度测定
  • 2.3 试验结果
  • 2.3.1 重组质粒pMD-18T/FeIFN-α和pMD-18T/FeIFN-ω的构建及鉴定
  • 2.3.2 表达质粒pET-His/FeIFN-ωpET-His/FeIFN-α的构建及鉴定
  • 2.3.3 重组质粒pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α的诱导表达
  • 2.3.4 重组蛋白的纯化结果及浓度
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 目的基因的制备
  • 2.4.2 重组质粒pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α的诱导表达
  • 2.4.3 蛋白的纯化
  • 3、猫干扰素FeIFN-ω和FeIFN-α的体外生物学活性研究
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 干扰素样品
  • 3.1.2 细胞系
  • 3.1.3 病毒株
  • 3.1.4 细胞培养用液
  • 3.1.5 主要仪器设备
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 细胞复苏
  • 3.2.2 病毒的扩增以及病毒效价滴定
  • 3.2.3 猫干扰素抗病毒活性的广谱性研究
  • 3.2.4 猫干扰素抗病毒活性的种属特异性研究
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 病毒的扩增以及病毒效价滴定
  • 3.3.2 猫干扰素抗病毒活性的广谱性研究
  • 3.3.3 猫干扰素抗病毒活性的种属特异性研究
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 细胞培养时应该注意
  • 3.4.2 病毒扩增时应该注意
  • 3.4.3 干扰素抗病毒活性测定方法
  • 3.4.4 干扰素的抗病毒活性研究
  • 4、结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文
  • 缩略词表

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