串联18O同位素标记应用于定量糖蛋白质组研究

论文摘要

近年来,随着蛋白质组学（proteomics）的快速发展,蛋白质的翻译后修饰引起了越来越多的关注,特别是蛋白质糖基化修饰。蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一,在许多重要的生理和病理过程中起着重要的作用。随着糖蛋白/糖肽富集技术和生物质谱技术等的发展,大规模N-型糖蛋白的糖基化位点鉴定得以实现。但关于N-糖基化位点的糖基化程度定量,及糖基化程度变化和蛋白表达水平变化的关系研究的很少。基于此,本论文发展了一种串联18O稳定同位素标记方法(Tandem18O Stable Isotope Labeling,TOSIL),用于对N-糖基化位点的糖基化程度进行相对定量,并比较糖基化程度变化和蛋白表达水平变化的关系。本论文由四部分组成。第一章绪论首先介绍了蛋白质糖基化修饰研究现状,尤其对糖蛋白/糖肽及糖基化程度定量方面的研究进展做了综述;概述了卵巢癌的蛋白质组学研究进展,说明了本论文选题目的和意义。第二章所述工作用两种标准糖蛋白发展了串联18O稳定同位素标记方法（TOSIL）,用于对N-糖基化位点的糖基化程度进行定量。概括来说,两组对照的样品分别在H216O或H218O水中进行胰蛋白酶酶解和PNGase F释放糖链,两步酶解都在H218O水中处理的糖肽（仅含一个糖基化位点）会被标记上三个18O原子:两个位于肽段的C末端,一个标记在糖基化位点上。分别用16O或18O标记的糖肽对峰产生6 Da的差异,而非糖肽仅在C末端标记氧原子,产生4 Da的差异,由此可以明显的区分糖肽和非糖肽,并同时对糖基化水平和蛋白水平进行定量。用16O或18O标记的两组样品混合后用Nano-LC-ESI-MS/MS进行分析,利用PMF图谱中对峰的强度进行相对定量。对该方法重复性和准确性的考查结果显示,在10倍动态范围内该方法有很好的线性关系（r2＞0.99）和重复性（SD在0.06到0.21之间）。TOSIL方法分析过程简单,易操作,引入了3个18O原子,减少了质谱峰的重叠,从而使得得到的定量信息足够准确。第三章工作是将TOSIL方法用于实际样品的分析。对卵巢癌血清样品和正常人血清样品中的N-糖基化位点进行了糖基化程度的相对定量分析,总共得到了49个糖蛋白中86个糖基化位点的定量信息。并对比分析了糖基化程度的变化和对应的蛋白水平的变化,从中发现了一些有特殊变化的糖基化位点。此外,还用Western-blot对蛋白水平的变化进行了验证,结果显示与TOSIL方法得出的结论一致。说明此方法可以大规模用于实际样品的分析,得到的结果准确、可靠。第四章是全文总结和展望。总结了主要的研究结果,设想了下一步研究的方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 第一章 绪论
• 1.1 糖蛋白质组学研究概述
• 1.2 糖蛋白质的分类
• 1.3 生物质谱在糖蛋白分析中的应用及糖蛋白质组学研究策略
• 1.4 糖蛋白及糖基化程度定量方法
• 1.5 卵巢癌的蛋白质组学研究概述
• 1.6 本论文的立意及创新点
• 18O同位素标记方法的建立'>2 第二章 串联¹⁸O同位素标记方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.3 实验结果
• 2.4 实验讨论
• 2.5 小结
• 3 第三章 卵巢癌血清中糖蛋白质组学定量分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 4 第四章 全文总结与展望
• 5 参考文献
• 6 致谢