论文摘要
背景:非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）是一组在不饮酒和几乎不饮酒人群中,除外病毒性肝炎、自身免疫性肝病、遗传性肝病等原因,以从单纯肝脂肪变性（Simple Hepatic Steatosis）到非酒精性脂肪性肝炎（Non-Alcoholic Steatohepatitis,NASH）、最终可进展为肝硬化为特征的广谱脂肪性肝病。近年来研究表明,胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）在NAFLD发病机制中起关键作用。生理剂量的胰岛素发挥不了相应的生物学效应即为胰岛素抵抗（IR）,遗传因素和环境因素均可诱导IR。近年来,环境因素对胰岛素抵抗的作用已引起人们更多的关注。目前认为:高脂高热量饮食、体力活动缺乏、吸烟以及精神压力过大等均是诱导胰岛素抵抗的重要环境危险因素,其中高脂饮食对胰岛素敏感性的影响是近年来的研究热点。大量的流行病学资料提示:长期高脂饮食人群的胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病发病率明显增高,即目前所谓脂毒性（Lipotoxicity）。实验研究资料也证实:高脂环境可以损害包括骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。因此,高脂环境已成为诱发胰岛素抵抗的独立危险因素之一。高脂环境诱导的胰岛素抵抗伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常。除传统的胰岛素信号传递途径外,近年来的研究还发现,高脂环境下AMP激活的蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase,AMPK）表达和活性的变化可能是胰岛素抵抗发生的上游机制。AMPK是新近发现的一种细胞内能量代谢的重要的调节因子。其最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP/ATP比值的变化,调节脂肪酸的氧化代谢。运动、缺氧、能量缺乏及AMPK激活剂均可激活AMPK。AMPK磷酸化后被激活,使乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase,ACC）磷酸化失活,进而降调胞浆内丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）的含量,后者是脂肪酸β氧化的关键酶—肉毒碱脂酰转移酶1（CPT1）的生理性抑制剂。胞浆内丙二酰辅酶A含量的降低,解除了其对CPT1的抑制作用,促进细胞内脂肪酸的β氧化供能。除调节机体能量代谢外,AMPK也参与机体胰岛素敏感性的调节。目前认为,AMPK是胰岛素敏感性的一种正调节因子,AMPK过表达或AMPK特异性激活剂均具有胰岛素增敏效应。AMPK影响胰岛素敏感性的具体机制目前认为与其对脂肪酸氧化代谢的调节作用有关。我们知道,细胞内脂肪酸的氧化代谢与胰岛素敏感性关系密切。一方面,有研究认为细胞内脂肪酸氧化代谢加强可以增加胰岛素敏感性;另一方面,也有研究认为细胞内脂肪酸氧化代谢不足可诱导胰岛素抵抗发生。如上文所述,AMPK激活可促进细胞内脂肪酸氧化代谢,这被认为是AMPK调节胰岛素敏感性的机制之一。除促进脂肪酸氧化代谢外,AMPK还参与调节GluT4的表达,这被认为是AMPK调节胰岛素敏感性的另一个可能机制。因而,AMPK作为机体一种能量代谢感受器,将机体能量代谢与胰岛素敏感性直接联系起来。新近研究发现,AMPK还是二甲双胍的靶分子。具有胰岛素增敏作用的口服降血糖药物二甲双胍,近几年已被证实为AMPKα的激活剂,可以增加大鼠骨骼肌AMPKα的表达及活性,改善脂毒性。肝脏作为能量代谢的重要器官之一,在调节机体糖、脂代谢方面发挥着重要作用。有小样本的临床研究显示,二甲双胍可改善NASH患者的胰岛素抵抗,降低血ALT和AST,减小肝脏体积,但其具体机制是否通过激活肝脏AMPK尚未阐明。过氧化物酶增殖体激活受体（Peroxisome Proliferator-Activated Receptors,PPARs）是配体激活的转录因子,属于核受体超家族。其中,PPARγ主要与胰岛素敏感性有关,PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物已作为胰岛素增敏剂在临床用于治疗2型糖尿病,实验研究证实其具有激活AMPK的作用;PPARα在调节脂代谢中发挥关键性作用。国外有研究认为AMPKα活化可通过激活PPARα和PPARγ的复合激活子-1（PGC-1）增加小鼠骨骼肌细胞的脂肪酸氧化。目前有关AMPK与PPARα、PPARγ之间关系的研究结果尚不一致,尚未见到在肝脏组织中二甲双胍对肝细胞PPARα、PPARγ活性影响的研究。本课题采用动物实验的方法,模拟人的高脂饮食,高脂饲养大鼠5个月,目的在于观察二甲双胍对长期高脂饲养大鼠肝脏AMPKα和PPARα、PPARγ表达和活性的影响,并观察体重、血糖、血胰岛素、血脂和肝脏脂质含量的变化,探讨长期高脂环境导致脂毒性和NAFLD及二甲双胍改善脂毒性和NAFLD的可能分子机制。在上述动物实验探讨脂毒性及NAFLD发生机制的基础上,为了探讨干预脂毒性和NAFLD的临床对策,我们设计了一项历时半年的临床前瞻性研究,对NAFLD伴有以糖、脂代谢紊乱为主的代谢综合征患者（非饮酒者）,在饮食调节的基础上,应用AMPK激活剂二甲双胍或PPARα激活剂非诺贝特干预,观察二甲双胍和非诺贝特对改善脂毒性和NAFLD的有效性和安全性。目的:①观察长期高脂饲养对大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响,及对血脂和肝脏脂质含量的影响,及二甲双胍干预后上述指标的变化。②观察长期高脂环境下,大鼠肝脏AMPKα、PPARα和PPARγ的活性及表达的改变。进一步观察加用AMPKα激活剂二甲双胍后,对高脂诱导的大鼠肝脏AMPKα、PPARα和PPARγ活性及表达变化的影响。探讨肝脏AMPKα、PPARα和PPARγ在高脂诱导的脂毒性和肝脏脂肪变性中的作用,及二甲双胍改善脂毒性和NAFLD的可能分子机制。③通过临床前瞻性研究,观察AMPKα激活剂二甲双胍和PPARα激活剂非诺贝特在调节糖、脂代谢紊乱的同时,对治疗NAFLD的有效性和安全性。进一步验证我们动物实验的结果。方法:①大鼠分组及饲养:雄性Wistar大鼠30只,适应性饲养1周后,按体重随机分为2组:对照（Control）组（C组）10只,给予大鼠食用的标准饲料,其中碳水化合物热卡占61%,脂肪热卡占11%;高脂饲养组20只,给予高脂饮食,脂肪热卡占59%,以饱和脂肪酸（猪大油）为主。高脂饲养组在4个月后再随机等分为2组:高脂（HF）组和高脂加二甲双胍（HF+MET）组,各10只。HF组继续高脂饲养。HF+MET组于高脂喂养第5个月开始,在高脂饲养的同时加用二甲双胍（商品名:格华止）,剂量50mg·kg-1·d-1,每天早9点定时灌胃,持续1个月。各组大鼠每同膳食热量控制在310KJ/只,喂养期均为5个月。②机体水平脂毒性评价:喂养期间监测大鼠体重和血糖水平;大鼠处死前,测体重、空腹血糖、空腹血胰岛素和血脂水平;大鼠处死后,测内肝脏脂质含量。③大鼠肝脏AMPKα、PPARα和PPARγ活性、基因和蛋白表达水平检测:RT-Real time PCR检测肝脏AMPKα1亚基、AMPKα2亚基和PPARα的mRNA水平;Western Blot检测AMPKα亚基、磷酸化AMPKα亚基（P-AMPKα）和PPARα的蛋白水平;酶联免疫吸附法（ELISA）测定PPARα、PPARγ转录因子的DNA结合活性。在此基础上,观察AMPK激活剂二甲双胍对高脂诱导的肝脏AMPK、PPARα和PPARγ变化的影响,及对脂毒性和肝脏脂肪变性的改善作用。④临床研究方法:对178例NAFLD伴有代谢综合征的患者（非饮酒者）,分四组:饮食控制组（对照组,D组）、在对照组干预措施基础上加用二甲双胍组（A组）、在对照组干预措施基础上加用非诺贝特组（B组）和不采取措施干预继续原方式生活者（C组）。随访观察半年,观察治疗前后体重（W）、体重指数（BMI）、腰围（WC）、血压（BP）空腹血糖（FPG）、2小时血糖（2hPG）、空腹胰岛素（FINS）、2hINS、稳态模式胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、血脂[包括:甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）]、肝功能、肾功能和血乳酸（Lactic acid,LA）的变化。糖代谢紊乱通过WHO推荐的75g口服葡萄糖耐量试验（Oral Glucose Tolerance Test,OGTT）评估。NAFLD的变化通过肝脏彩色超声改变结合肝酶学的变化进行评估（由同一指定的资深超声诊断专家在同一台彩色多普勒仪上,对比干预前后的肝脏彩色超声图象改变）。结果:①机体水平脂毒性的评价5个月后,HF组大鼠与对照组比较,体重、空腹血糖、空腹胰岛素水平分别增高51.1%（P＜0.01）、21.5%（P＜0.05）和17%（P＜0.05）。与HF组相比,HF+MET组大鼠体重降低24.7%（P＜0.01）,空腹血糖和胰岛素分别降低13%（P＜0.05）和10.8%（P＜0.05）。提示在机体水平上提示高脂组大鼠发生胰岛素抵抗和脂毒性,及二甲双胍对高脂诱导的脂毒性的改善作用。②大鼠血清和肝组织中甘油三酯和胆固醇水平变化HF组大鼠与对照组比较,血清甘油三酯和胆固醇均显著增高（P＜0.01）,肝细胞中甘油三酯和胆固醇含量均显著增高（P＜0.05）;与HF组相比,加用二甲双胍组大鼠血清和肝组织中甘油三酯和胆固醇均显著降低（P＜0.05）。提示长期高脂环境可导致脂代谢紊乱和NAFLD,及二甲双胍对高脂诱导的脂代谢紊乱和NAFLD的改善作用。③大鼠肝脏磷酸化AMPKα（P-AMPKα）、PPARα和PPARγ活性变化以P-AMPKα的蛋白含量表示AMPKα的活性,与对照组相比,HF组P-AMPKα蛋白表达水平降低59%（P＜0.05）;与HF组相比,加用二甲双胍组P-AMPKα蛋白表达水平增高89.1%（P＜0.05）。提示长期高脂喂养可显著降低大鼠肝脏AMPKα活性,二甲双胍可显著改善高脂导致的其活性损害,证实二甲双胍在肝脏具有激活AMPKα作用。与对照组相比,高脂组大鼠肝脏PPARα和PPARγ转录因子活性水平分别降低21.6%（P＞0.05）和16.7%（P＞0.05）;加用二甲双胍后高脂饲养大鼠肝脏PPARα和PPARγ转录因子活性水平分别增高55%（P＜0.05）和5.7%（P＞0.05）,提示长期高脂环境可导致大鼠肝脏PPARα转录因子活性一定程度的降低,二甲双胍可使PPARα转录因子活性显著增强;而PPARγ转录因子活性的降低和增高均未达到显著性差异,因此未再进一步观察其基因和蛋白表达水平的变化。④肝脏AMPKα1、AMPKα2和PPARαmRNA表达水平变化与对照组比较,HF组肝脏AMPKα2和PPARαmRNA表达水平分别减少83%和62.5%,均有显著性差异（P＜0.05）,AMPKα1减少49%（P＞0.05）。与HF组相比,加用二甲双胍组AMPKα2 mRNA表达水平增高62%,有显著的变化（P＜0.05）;AMPKα1和PPARαmRNA水平分别增加52%、46.8%,但均无显著性差异（P＞0.05）。提示长期高脂喂养可显著降低大鼠肝脏AMPKα和PPARα的基因表达水平,二甲双胍可明显改善高脂导致的AMPKα基因表达的损害,PPARα的基因表达也得到较明显的改善。⑤肝脏AMPKα和PPARα蛋白表达水平的变化与对照组相比,HF组AMPKα蛋白表达水平降低66.1%（P＜0.05）,PPARα降低48.6%（P＞0.05）;与HF组相比,加用二甲双胍组AMPKα蛋白表达水平增高232%（P＜0.05）,PPARα增高56.5%（P＞0.05）。提示长期高脂喂养可显著降低大鼠肝脏AMPKα蛋白表达,PPARα的蛋白表达水平也有较明显的下降,二甲双胍可明显改善高脂导致的AMPKα蛋白表达损害,PPARα的蛋白表达也得到较明显的改善。⑥临床研究的结果研究结束时,A组有90%的患者血糖转为正常（NGT）,显著高于B组的60%（P＜0.05）和D组的35%（P＜0.01）;A组有70%的患者血TG降至1.7mmol/L以下,显著高于D组的40%（P＜0.05）和显著低于B组的95%（P＜0.05）;A组NAFLD的好转率达92%,显著高于B组的70%（P＜0.05）和D组的40%（P＜0.01）;同时,A组患者MS患病率减少到25%,显著低于B组的40%（P＜0.05）和D组的55%（P＜0.01）。B组与D组比较,其NGT率（P＜0.05）、TG＜1.7mmol/L的患者比率（P＜0.01）和NAFLD的好转率（P＜0.05）均显著增高,MS患病率相应地显著减少（P＜0.05）。D组患者血糖、血脂均较6个月前显著增高,有15例患者由IGR转为DM,D组的NAFLD也明显加重。研究结束时,A组患者的W（P＜0.01）、BMI（P＜0.01）、WC（P＜0.01）、SBP（P＜0.05）、FPG（P＜0.05）、2hPG（P＜0.01）、FINS（P＜0.05）、2hINS（P＜0.01）、HOMA-IR（P＜0.05）、TG（P＜0.01）、TC（P＜0.05）、ALT（P＜0.01）和AST（P＜0.01）的平均水平均较干预前显著降低,其中,W、BMI、WC、2hPG、2hINS、TG、ALT和AST较前降低的显著程度较高。W、BMI、WC、FPG和TG在治疗4个月时既显著下降（分别P＜0.05）。提示A组患者腹型肥胖程度、血糖和胰岛素、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、NAFLD均较治疗前明显好转。ALT和AST的显著下降提示NAFLD（包括NASH）明显好转。同时观察到SBP也较治疗前明显下降,有助减少MS患者比率。B组患者的W（P＜0.05）、BMI（P＜0.05）、WC（P＜0.05）、SBP（P＜0.05）、FPG（P＜0.05）、2hPG（P＜0.05）、FINS（P＜0.05）、2hINS（P＜0.01）、HOMA-IR（P＜0.05）、TG（P＜0.01）、TC（P＜0.01）和ALT（P＜0.05）均较干预前显著降低,其中,2hINS、TG和TC降低最显著（P均＜0.01）,而所观察的其他指标变化未见显著差异。在治疗2个月和4个月时既检测到TG显著下降（分别P＜0.05,P＜0.01）,第4个月时TC也显著下降（P＜0.05）。随着体重减轻和脂代谢紊乱的明显改善,在6个月后患者的胰岛素抵抗明显减轻,血糖、胰岛素水平明显下降,SBP也显著下降,MS患者明显减少,NAFLD（包括NASH）的好转率较对照组明显增高。C组患者WC明显增加,其糖、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗及NAFLD均明显加重,糖尿病的发生率显著增高。D组患者W、BMI、WC、2hPG、2hINS、TG和TC较干预前显著降低（分别P＜0.05）,HOMA-IR下降未见显著差异,NAFLD好转率为40%,提示患者的肥胖程度、糖和脂代谢紊乱、NAFLD也较治疗前一定程度上好转。A组患者腹型肥胖程度、血糖和胰岛素及胰岛素抵抗、NAFLD的好转程度高于B组,TG和TC下降的幅度不如B组的显著（P＜0.05）。在研究过程中,A组患者的血LA水平无显著性增高,仅有1例因胃肠道症状和血LA增高退出研究。未出现临床应用二甲双胍和非诺贝特的明显不良反应。结论:①长期高脂环境可诱导大鼠胰岛素抵抗,导致脂毒性和NAFLD的发生。②长期高脂环境可降低大鼠肝脏AMPKα和PPARα的表达和活性,这是高脂诱导胰岛素抵抗、脂毒性和NAFLD的可能机制之一。③二甲双胍可增强大鼠肝脏AMPKα和PPARα的表达和活性,对高脂诱导的大鼠胰岛素抵抗、脂毒性和NAFLD有明显的改善作用。④对于NAFLD伴MS患者,饮食和生活方式干预仍然是改善脂毒性和NAFLD最基本措施;二甲双胍不仅能有效地降低血糖、减轻腹型肥胖和改善胰岛素敏感性,而且能明显地降低血脂和减轻NAFLD,且应用比较安全;非诺贝他在有效降低血TG和TC的同时,也能在一定程度上改善胰岛素敏感性、降低血糖和减轻NAFLD。
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