论文题目: CTGF在人近端肾小管上皮细胞上皮—间充质转变中的作用研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 内科学
作者: 张建东
导师: 刘必成
关键词: 人近端肾小管上皮细胞,上皮间充质转变,肾间质纤维化,结缔组织生长因子,整合素连接激酶
文献来源: 东南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:肾间质纤维化是各种原因导致的终末期肾病的共同通路。最近研究表明肾小上皮细胞间充质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肾间质纤维化中的核心事件。结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor, CTGF)是新近发现的一个重要的致纤维化因子。从蛋白结构看CTGF由4个不同的模块组成,CTGF在体内以包含不同模块的全长及不同长度的片段形式存在。人们发现CTGF具有许多复杂甚或相互矛盾的作用,联系到其多模块的结构特点,有作者开始从结构-功能学角度来探讨CTGF的作用基础。在这些先锋性的实验中提示模块4可能具有较为突出的作用。CTGF在多种慢性肾脏病中表达增高,提示CTGF与慢性肾脏病进展相关,进一步的工作发现CTGF能参与肾脏细胞的增殖、EMT及增加肾间质纤维物质堆积等多种肾脏纤维化的事件。有关CTGF在肾脏纤维化中的结构学基础如何?是否其致纤维化效应由模块4介导?目前尚未见报道。本研究采用重组的不同片段的CTGF来直接研究CTGF在EMT中的作用及其结构基础。方法:人近端肾小管上皮细胞株(human proximal tubular cell line, HPTCL) HK-2用含10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的低糖型Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)培养液培养。无血清培养24小时后,用重组CTGF(C)(只包含模块4)干预细胞,通过MTT法监测细胞增殖指数,摸索出最适浓度-时间点,用流式细胞分析技术检测其对细胞周期的作用及抗CTGF抗体对这一作用的影响。选取50ng/ml rhCTGF(C)干预细胞0-48h,通过免疫细胞化学、Real-Time PCR观察其对角蛋白、波形蛋白表达的影响,同时通过倒置相差显微镜观察细胞形态改变,采用共聚焦显微镜技术观察其对纤维连接蛋白表达的影响。在此基础上我们还采用免疫细胞化学、Real-Time PCR技术观察0-72h ILK (integrin-linked kinase)mRNA和蛋白质表达时间效应关系;观察不同浓度rhCTGF(C)(0-50ng/ml)作用细胞48h后,HK-2细胞ILK mRNA和蛋白质表达的浓度效应关系。同时我们还观察了抗CTGF抗体对rhCTGF(C)的这些作用的影响以及比较了rhCTGF(N)(包含模块1,2,3不包括模块4)对这些指标的作用。结果:结果显示在50ng/ml范围内rhCTGF(C)能促进HK-2细胞增殖,呈浓度依赖性增强(P<0.05)。在100ng/ml-1ug/ml浓度范围内rhCTGF(C)呈浓度依赖性抑制HK-2细胞生长(P<0.05)。50ng/ml rhCTGF(C)作用HK-2细胞12h后即可显著性诱使HK-2细胞增殖(P<0.05),此作用呈时间依赖性增强。rhCTGF(C)作用48h后, G0-G1期细胞减少(p<0.05),S期细胞增多(p<0.01),anti-CTGF antibody干预后能明显减轻这一现象(P<0.05)。rhCTGF(C)可以呈时间依赖性下调CK(cytokeratin) mRNA和蛋白质表达及上调VIM(vimentin) mRNA和蛋白质表达(P分别<0.05 vs control)。RhCTGF(C)可以明显使HK-2细胞伸长为长梭形。rhCTGF(C)可以增加FN(fibronectin)的合成,呈时间依赖性(P<0.05)。RhCTGF(C)在5 ng/ml时就可以增加ILKmRNA和蛋白质表达,呈浓度依赖性(P<0.05)。RhCTGF(C)作用24h起即可上调ILKmRNA和蛋白质表达(P<0.05),并呈时间依赖性。抗CTGF抗体可以阻断这些作用(P<0.05),而rhCTGF(N)与正常对照组相比无明显改变。结论: 1.在一定的浓度范围内,重组的CTGF模块4蛋白可以促进肾小管上皮细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性;加速肾小管上皮细胞从G1期向S期的转变。2.重组的CTGF模块4蛋白可以诱导肾小管上皮细胞发生EMT,而rhCTGF(N)未能诱导肾小管上皮细胞发生EMT。3.重组的CTGF模块4蛋白可以促进肾小管上皮细胞细胞外基质的合成,而rhCTGF(N)未能促进细胞外基质的合成。4.在一定的浓度范围内,重组的CTGF模块4蛋白可以直接促进ILK mRNA和蛋白的表达,呈浓度和时间依赖性; rhCTGF(N)未能促进ILK的表达。
论文目录:
一、中文摘要
二、英文摘要
三、前言
四 文献综述
五材料和方法
六 研究内容
七结果
八 讨论
九 结论
十 致谢
十一 参考文献
十二 作者简介
十三 附录
发布时间: 2007-06-11
参考文献
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