棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化

棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化

论文摘要

棉花黄萎病是棉花生长过程中一种最具破坏力的真菌病害,在世界范围内流行。该病害不仅严重影响棉纤维产量,降低幅度达20-60%,而且能大幅度降低棉纤维的品质。棉花黄萎病已经成为世界上棉花生产的主要障碍。利用遗传工程技术改良棉花品种可以提高棉花的抗病性。农杆菌介导法是目前应用最广泛、转化机理最清楚的基因转化方法。然而,农杆菌介导的棉花基因转化存在很多问题,如棉花组织培养的基因型依赖性、转化效率低、转基因植株基因表达沉默等等,这些问题已经成为棉花基因工程研究领域的障碍和瓶颈。本研究主要以陆地棉品系5983为材料,优化了组织培养体系和基因转化体系,将从苜蓿种子中克隆的苜蓿抗菌肽基因导入到棉花中,经检测获得了抗黄萎病的转基因棉花。棉花纤维的生长发育是依赖于一系列基因的调控。但由于棉花基因遗传转化需要大量的人力和物力,转化和生长周期长,大规模进行棉纤维基因功能分析非常困难,基因是如何调控棉纤维的生长发育还不是很清楚。因此,有必要建立一套快速简单的棉纤维基因功能鉴定的瞬时表达方法。本研究以GUS为报告基因,采用棉花胚珠离体培养技术,基因枪转化、子房注射法,建立了两套外源基因转化棉纤维的瞬时表达体系。将取得的研究成果归纳如下:1.棉花组织培养体系的优化以5-7日苗龄无菌苗下胚轴切段为外植体,在以LS和MSB培养基为基本培养基,共15种不同激素配比培养基上诱导愈伤组织。结果表明,不同培养基类型和激素组合对愈伤组织的诱导都有重要的影响。同样激素处理条件下,LS培养基上诱导出的愈伤组织要好于MSB培养基,愈伤组织大都为黄绿色,具有分化为胚性愈伤组织的潜力。在所有的激素组合中,在含0.1mg/L KT和0.2mg/L2,4-D的LS培养基中诱导的愈伤组织最好,颜色为黄绿色,质地松软。而其他组合的培养基上诱导的愈伤组织则呈白色硬块或褐色稀泥状,分化为胚性愈伤组织的潜力小。将获得的愈伤组织继代到四种不同的培养基上,在MSB培养基上增殖的愈伤组织的色泽和质地要好于LS培养基上的愈伤组织。在MSB培养基上增殖的大部分愈伤组织为淡绿色或粉红色,而LS培养基上增殖的愈伤组织则是白色硬块愈伤。ZT或活性炭的加入降低了愈伤组织的增殖速度。将在MSB培养基上增殖的愈伤组织转移到6种含不同激素种类及配比的MSB培养基上。结果表明,0.3mg/L KT和0.5mg/L IBA组合的效果优于其他组合,在这个培养基上产生的子叶胚数和总胚数最多。获得的胚状体放在含0.5 mg/L NAA的1/2MSB培养基上诱导绿苗形成。5μmol/LNi2+和Zn2+能促进胚性愈伤组织的分化和绿苗的萌发。待幼苗长到5-8cm时,采用直接移栽和嫁接移栽的方法将苗移到温室。2.棉花转基因体系的优化以含质粒pCAMBIA1301的农杆菌介导棉花下胚轴切段,50mg/L的潮霉素加入到培养基中筛选抗性愈伤组织,优化了农杆菌介导的棉花遗传转化的影响因子。研究结果表明:不同农杆菌菌种对棉花的浸染能力不同,在三种农杆菌菌种中,农杆菌LBA4404的浸染能力最强。农杆菌菌液浓度OD600值在O.5-0.7时,培养基中加200μmol/L乙酰丁香酮,浸染10-15min,在50mg/L潮霉素培养基筛选后,愈伤组织转化率最高。共培养温度和时间对愈伤组织转化率也有明显的影响。研究表明在共培养温度21℃下,共培养60 h,转化效果最好。3.植物表达载体的构建与转基因棉花的筛选从苜蓿种子中克隆了已知基因苜蓿抗菌肽基因(alfAFP),并将其连接到质粒pCAMBIA1301中。基因的表达由CaMV35S启动子驱动。用已经优化的基因转化体系进行目的基因转化,待再生苗5-8 cm高时,将其直接移栽到温室,最后共得到15颗再生植株。经潮霉素涂抹,发现有3株是假阳性植株。对其余12个转基因植株进行分子检测,PCR结果表明在12个转基因植株的基因组DNA中都有目的基因存在,而在对照植株的基因组DNA中检测不到目的基因的存在。随后,为检测外源基因在棉花基因组中的整合,对这12个转化植株进行Southern检测。结果表明,在12个转化植株中都能检测到Southern杂交信号,有6株是单拷贝整合,另外6株是双拷贝整合。提取12个转基因植株根部的RNA,Northem检测都有杂交信号,说明外源DNA在转基因植株根部都有转录。4.转基因棉花的抗病性鉴定、生理特性表现和农艺性状表现离体抗病检测结果表明,转化植株叶片粗提液的处理产生的菌落数显著(P<0.01)少于对照,大丽轮枝菌的生长被抑制46.2-86.8%,表明外源抗菌肽在转基因棉叶中含量较高。为鉴定转基因植株的抗病性,用50ml大丽轮枝菌孢子悬浮液接种转基因植株和对照植株的根部。在成熟期调查黄萎病的发病级别。结果表明,12个转基因植株中,有5株是黄萎病免疫株,有3株为1级发病,3株是2级发病,有1株发病严重,是3级。离体抗病检测和转基因植株接菌检测结果都表明,alfAFP基因的导入不同程度的提高了棉花对黄萎病的抗性。抗病鉴定的同时,我们测定了四个与抗病相关的酶在接菌后的活性变化。四个酶活性的变化趋势相同。对照植株接菌后酶活性有一个快速升高和快速降低的过程。转基因植株中,部分抗性植株酶活性变化也有一个升高和降低的过程,但变化幅度较小,而黄萎病免疫植株的酶活性变化则相当平缓,没有明显的峰值。外源基因的导入对棉花农艺性状也有较大的影响。转基因植株株高普遍降低,果枝数、果节数和铃数显著减少,铃重大大降低,但对衣分的影响不大。在纤维品质性状中,纤维比强度下降,马克隆值有不同程度的增加,纤维长度的变化不一致,有的增长,有的变短。5.棉纤维基因转化的瞬时表达体系的建立1DPA胚珠预培养1 d后,用基因枪轰击。在轰击压力1100psi,射程9 cm,真空度28英寸汞柱,质粒用量为2μg/枪的条件下,GUS染色瞬时表达效果最好。轰击后GUS染色表明,该基因可以在纤维发育的第3-22天持续表达,即该转化体系可以检测纤维发育第3-22天内相关基因的表达。子房注射法转化外源基因,质粒浓度为0.04-0.07μg/μl之间时转化效果最好。注射开花后1DPA子房,胚珠GUS染色表明,注射后第3天的GUS表达率最高,外源基因可以在纤维中持续表达9天。即该转化体系可以检测纤维发育第2-10天内相关基因的表达。

论文目录

  • 致谢
  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 缩写词表(Abbreviations)
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 棉花组织培养
  • 1.1.1 植物组织培养概述
  • 1.1.2 棉花体细胞培养及影响因素
  • 1.1.2.1 棉花体细胞培养
  • 1.1.2.2 棉花体细胞培养的影响因素
  • 1.1.2.3 棉花体细胞培养中存在的问题
  • 1.2 棉花遗传转化的研究进展
  • 1.2.1 棉花遗传转化研究的方法
  • 1.2.1.1 根癌农杆菌介导法
  • 1.2.1.2 基因枪法
  • 1.2.1.3 农杆菌法和基因枪法相结合
  • 1.2.1.4 花粉管通道法
  • 1.2.1.5 其他途径
  • 1.2.2 棉花遗传转化的成就
  • 1.2.2.1 抗虫基因的分离与转基因抗虫棉的获得
  • 1.2.2.2 抗除草剂基因工程棉花
  • 1.2.2.3 抗逆及品质改良转基因棉花
  • 1.2.2.4 转基因彩色棉
  • 1.3 棉花抗黄萎病研究
  • 1.3.1 棉花黄萎病致病机理及其抗性遗传
  • 1.3.1.1 黄萎病致病机制
  • 1.3.1.2 棉花抗黄萎病的遗传方式
  • 1.3.2 棉花对黄萎病抗病机制的研究进展
  • 1.3.2.1 棉花对黄萎病的形态抗性
  • 1.3.2.2 棉花对黄萎病的生理生化抗性
  • 1.3.2.3 棉花对黄萎病的生态抗性
  • 1.3.3 棉花抗黄萎病育种研究进展
  • 1.3.3.1 利用抗病性种质资源的育种研究进展
  • 1.3.3.2 棉花转基因抗黄萎病的研究进展
  • 1.3.4 目前存在的问题及解决办法
  • 1.4 棉花纤维发育研究进展
  • 1.4.1 棉花纤维细胞的分化与发育
  • 1.4.1.1 棉花纤维细胞的分化和突起
  • 1.4.1.2 棉纤维的伸长
  • 1.4.1.3 棉纤维次生壁的形成
  • 1.4.1.4 脱水成熟
  • 1.4.2 棉花胚珠离体培养体系的建立
  • 1.4.2.1 棉花胚珠离体培养体系的建立
  • 1.4.2.2 棉花胚珠离体培养在研究棉花纤维起始和发育研究中的应用
  • 1.4.3 棉纤维特异启动子的研究进展
  • 1.5 本研究的主要内容及意义
  • 第二章 棉花组织培养体系的优化
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 实验方法
  • 2.1.2.1 培养基的配制
  • 2.1.2.2 培养方法
  • 2.1.2.3 几种金属离子对棉花体细胞培养的影响
  • 2.1.2.4 试管苗的移栽
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 基本培养基及激素对诱导愈伤组织的影响
  • 2.2.2 不同培养基对愈伤组织继代培养的影响
  • 2.2.3 激素种类及配比对胚性愈伤组织的诱导和胚状体发生的影响
  • 2.2.5 几种金属离子在棉花组织培养中的作用
  • 2.2.5.1 四种金属离子在棉花愈伤组织诱导和分化中的作用
  • 2.2.5.2 愈伤组织继代和分化过程中多种金属离子的协同作用
  • 2.2.6 苗的直接移栽和嫁接移栽
  • 2.2.6.1 直接移栽
  • 2.2.6.2 嫁接移栽
  • 2.2.7 陆地棉体细胞胚胎发生和植株再生
  • 2.3 讨论
  • 2.3.1 基本培养基对愈伤诱导的影响
  • 2.3.2 激素对棉花体细胞培养中胚性愈伤组织诱导的影响
  • 2.3.3 几种金属离子对棉花体细胞培养的影响
  • 2.3.4 棉花再生植株移栽的关键技术
  • 第三章 农杆菌介导的棉花基因转化体系的优化
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 棉花农杆菌转化体系的优化
  • 3.1.2.1 培养基及培养条件
  • 3.1.2.2 转化方法
  • 3.1.3 农杆菌介导棉花下胚轴转化的因子优化
  • 3.1.3.1 潮霉素有效浓度的筛选试验
  • 3.1.3.2 羧苄青霉素和头孢霉素对下胚轴诱导愈伤组织的影响
  • 3.1.3.3 菌种对基因转化的影响
  • 3.1.3.4 农杆菌菌液浓度对基因转化的影响
  • 3.1.3.5 浸染时间对基因转化的影响
  • 3.1.3.6 乙酰丁香酮的浓度对基因转化的影响
  • 3.1.3.7 共培养温度对基因转化的影响
  • 3.1.3.8 共培养时间对基因转化影响
  • 3.1.4 抗性愈伤组织的GUS检测
  • 3.1.5 PCR检测
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 下胚轴和愈伤组织对潮霉素的敏感性
  • 3.2.2 羧苄青霉素和头孢霉素对出愈率的影响
  • 3.2.3 农杆菌菌种对基因转化的影响
  • 3.2.4 农杆菌菌液浓度对基因转化的影响
  • 3.2.5 农杆菌浸染下胚轴的时间对基因转化的影响
  • 3.2.6 乙酰丁香酮(AS)对转化率的影响
  • 3.2.7 共培养温度对基因转化的影响
  • 3.2.8 共培养时间对基因转化的影响
  • 3.2.9 农杆菌介导棉花下胚轴基因转化的程序
  • 3.2.10 抗性愈伤组织(转化体)的鉴定
  • 3.2.10.1 抗性愈伤组织的GUS染色
  • 3.2.10.2 抗性愈伤组织的PCR检测
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 基因转化中的抗生素选择
  • 3.3.2 农杆菌菌种和菌液浓度对基因转化的影响
  • 3.3.3 共培养对基因转化的影响
  • 3.3.4 乙酰丁香酮对基因转化的影响
  • 第四章 转抗菌肽基因棉花的获得
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 方法
  • 4.1.2.1 苜蓿种子总RNA的提取
  • 4.1.2.2 cDNA第一链的合成
  • 4.1.2.3 PCR扩增目的基因
  • 4.1.2.4 目的基因的克隆和测序
  • 4.1.2.5 目的片段与双元载体连接和转化
  • 4.1.2.6 感受态农杆菌的制备
  • 4.1.2.7 冻融法转化农杆菌
  • 4.1.2.8 棉花的遗传转化
  • 4.1.2.9 转化体的潮霉素抗性检测
  • 4.1.2.10 转基因植株的分子检测
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 双元载体pCAMBIA1301-alfAFP的构建
  • 4.2.1.1 RNA的提取和反转录
  • 4.2.1.2 alfAFP基因的扩增及测序
  • 4.2.1.3 alfAFP基因与双元载体连接
  • 4.2.2 转基因植株的获得
  • 4.2.3 转基因植株的潮霉素检测
  • 4.2.4 转基因植株的分子检测
  • 4.2.4.1 转基因植株的总DNA提取
  • 4.2.4.2 转基因植株的PCR检测
  • 4.2.4.3 转基因植株的Southern检测
  • 4.2.4.4 转基因植株的Northern检测
  • 4.3 讨论
  • 第五章 转抗菌肽基因棉株的生物学特性与抗病性鉴定
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 方法
  • 5.1.2.1 转基因棉株抗病性检测
  • 5.1.2.2 转基因棉株几个生理指标的测定
  • 5.1.2.3 转基因棉株农艺性状的调查
  • 5.2 结果与分析
  • 5.2.1 转基因棉株的抗病性
  • 5.2.1.1 转基因棉株抗病性的离体检测
  • 5.2.1.2 转基因棉株抗病性的活体检测
  • 5.2.2 与抗病相关的几个生理指标的测定
  • 5.2.3 转基因棉株性状的调查
  • 5.3 讨论
  • 第六章 以棉花胚珠为材料的纤维瞬时表达基因转化体系的建立
  • 6.1 材料与方法
  • 实验一 基因枪介导的棉纤维瞬时表达基因转化体系的建立
  • 6.1.1.1 实验材料
  • 6.1.1.2 实验方法
  • 6.1.1.2.1 质粒的提取
  • 6.1.1.2.2 棉花胚珠培养
  • 6.1.1.2.3 转化体系的建立
  • 6.1.1.2.4 基因枪轰击棉花胚珠过程中参数的优化
  • 实验二 子房注射法介导的棉纤维瞬时基因转化体系的建立
  • 6.1.2.1 实验材料
  • 6.1.2.2 实验方法
  • 6.1.2.2.1 质粒的大量提取
  • 6.1.2.2.2 子房注射操作方法
  • 6.1.2.2.3 GUS检测
  • 实验三 农杆菌介导的棉花纤维瞬时表达基因转化体系的建立
  • 6.1.3.1 实验材料
  • 6.1.3.2 实验方法
  • 6.1.3.2.1 质粒的提取及农杆菌的转化
  • 6.1.3.2.2 棉花胚珠培养
  • 6.1.3.2.3 转化体系的建立
  • 6.2 结果与分析
  • 6.2.1 基因枪介导的棉花纤维瞬时表达基因转化体系的建立
  • 6.2.1.1 预培养天数对转化率的影响
  • 6.2.1.2 真空度对转化率的影响
  • 6.2.1.3 不同轰击距离对转化率的影响
  • 6.2.1.4 质粒用量对转化率的影响
  • 6.2.1.5 基因枪轰击棉纤维后的GUS表达
  • 6.2.2 子房注射法棉花纤维瞬时表达基因转化体系的建立
  • 6.2.2.1 不同DNA浓度对转化率影响
  • 6.2.2.2 子房注射外源质粒pCAMBIA1301后不同天数GUS的表达率
  • 6.2.2.3 纤维特异表达启动子RDL1在纤维中的表达
  • 6.2.3 农杆菌转化法棉花纤维转化体系的建立
  • 6.3 讨论
  • 第七章 总结与展望
  • 参考文献
  • 作者简历
  • 相关论文文献

    • [1].不同提取工艺对高山红景天愈伤组织抗氧化活性的影响[J]. 延边大学农学学报 2019(04)
    • [2].泓森槐茎段愈伤组织形成及继代增殖的研究[J]. 佳木斯大学学报(自然科学版) 2020(03)
    • [3].玉米单倍体胚性愈伤的诱导与鉴定[J]. 核农学报 2019(04)
    • [4].欧洲卫矛愈伤组织分化及其生理生化特性[J]. 安徽农业大学学报 2019(03)
    • [5].离体培养基诱导型愈伤组织形成的分子机制[J]. 生物学教学 2017(01)
    • [6].尾巨桉不同类型愈伤组织抗性相关酶活性差异与不定芽分化关系研究[J]. 基因组学与应用生物学 2017(02)
    • [7].蕨麻愈伤组织原生质体制备条件的优化[J]. 西北植物学报 2017(08)
    • [8].三七愈伤组织对滇重楼种子萌发的影响[J]. 山西农业科学 2017(09)
    • [9].两性株番木瓜愈伤组织分化初探(英文)[J]. Agricultural Science & Technology 2016(06)
    • [10].籼稻胚性愈伤组织继代培养基体系优化及愈伤组织褐化原因剖析[J]. 农业生物技术学报 2016(09)
    • [11].沙打旺愈伤组织再分化及植株形成的研究进展[J]. 畜牧与饲料科学 2016(08)
    • [12].观赏树木组培愈伤组织分化研究进展[J]. 福建林业科技 2014(04)
    • [13].过氧化氢诱导不同色素水平葡萄愈伤组织白藜芦醇及白藜芦醇苷含量差异[J]. 北方园艺 2015(08)
    • [14].碳纳米管对粳稻愈伤组织分化影响的研究[J]. 湖北农业科学 2015(19)
    • [15].两性株番木瓜愈伤组织分化初探[J]. 中国南方果树 2015(06)
    • [16].让生命在场[J]. 中学生物教学 2017(05)
    • [17].栀子叶片形成愈伤组织的最佳浓度配比探究[J]. 实验教学与仪器 2016(12)
    • [18].蓖麻愈伤组织对铜的抗性研究(英文)[J]. Agricultural Science & Technology 2013(12)
    • [19].伤害诱导白木香愈伤组织形成倍半萜过程中活性氧的产生和积累[J]. 中国药学杂志 2019(23)
    • [20].荻幼穗诱导不同类型愈伤组织的差异[J]. 草业科学 2019(07)
    • [21].半夏两种愈伤组织结构及细胞壁成分比较[J]. 山地农业生物学报 2018(01)
    • [22].采后苯丙噻重氮处理促进梨果实的愈伤[J]. 食品科学 2018(09)
    • [23].马铃薯松散型愈伤组织再生体系的建立[J]. 天津农业科学 2018(08)
    • [24].钩藤愈伤组织的诱导与植株再生[J]. 中国农学通报 2018(28)
    • [25].继代次数对吉粳88愈伤组织生理生化指标及细胞形态的影响[J]. 安徽农业科学 2016(05)
    • [26].彩叶芋愈伤组织的诱导、增殖及植株再生[J]. 江苏农业科学 2016(09)
    • [27].培养基对当归愈伤组织的诱导及分化影响研究[J]. 甘肃农业科技 2015(01)
    • [28].枸杞抗炭疽病菌毒素愈伤组织变异体的离体筛选及其防御酶活性研究[J]. 西北林学院学报 2015(03)
    • [29].模拟空间环境对朱砂根愈伤组织岩白菜素合成的影响[J]. 福建农业学报 2015(07)
    • [30].不同激素配比对诱导三七花蕾愈伤组织影响[J]. 文山学院学报 2014(03)

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

    棉花转基因体系的优化和抗黄萎病基因的转化
    下载Doc文档

    猜你喜欢