转反义LeEIL2基因番茄植株鉴定及采后生理特性的研究

论文摘要

乙烯是一种结构最简单的植物激素,调控植物自身的生长发育和成熟衰老,通过它的感受及信号转导实现其生理作用。乙烯的生物合成途径早在上世纪70年代末就已经阐明并得到广泛的研究。90年代建立了拟南芥乙烯信号转导途径模型:C2H2→ETR→CTR→EIN2→EIN3→ERF→乙烯反应。EIN3基因首先是从拟南芥的突变体中克隆得到的,作用于CTR下游,位于核内,编码转录因子。LeEIL2是从番茄离体叶片中克隆得到的EIN3的同源基因。本实验室人员在研究LeEIL2基因序列的基础上,克隆得到LeEIL2基因序列,成功构建了反义LeEIL2植物表达载体,利用农杆菌介导法进行遗传转化,成功获得了98株具有抗性的转反义LeEIL2基因番茄植株。 本研究对具有抗性的转反义LeEIL2基因番茄植株进行了PCR检测和杂交鉴定,筛选出阳性植株,继而对阳性植株采后番茄果实及叶片的相关生理特性进行研究,希望能进一步认识LeEIL2基因在番茄成熟衰老进程及乙烯信号转导途径中的作用和生理功能。 本实验主要进行了以下三方面的工作,并取得了相应的研究结果: （1） 具抗性转反义LeEIL2基因番茄植株的移栽及鉴定:从生根培养基上筛选出长势较好的抗性苗,移入营养土中进行培养,进而定植于温室中。总共移植成活了98株具有抗性的转反义LeEIL2基因番茄植株。取番茄植株叶片进行PCR检测,初步获得72株PCR水平呈阳性的转基因植株。进而对这72株植株进行Southern杂交鉴定,最终获得了58株阳性转反义LeEIL2基因番茄植株。 （2） 转反义LeEIL2基因番茄植株果实采后生理特性研究:实验测定了与果实采后成熟衰老、品质变化及贮藏性能相关的一系列指标,如乙烯生成量、呼吸速率、果实硬度、可溶性固形物含量、番茄红素含量、激素含量、ACS和ACO活性等。测定结果从各个角度充分说明,转反义LeEIL2基因番茄果实与普通番茄相比,其果实的成熟衰老进程极大程度受到抑制,果实品质得以提高,果实耐贮性也相应增强。 （3） 转反义LeEIL2基因番茄植株离体叶片生理特性研究:实验对番茄植株离体叶片伤乙烯、膜透性和叶绿素含量分别进行了测定。结果显示转反义LeEIL2基因番茄与普通番茄相比,离体叶片伤乙烯释放受到抑制、叶绿素含量高于同时期普通番茄,并且膜电解质渗出率相应降低,说明转反义LeEIL2基因番茄叶片的衰老进程可能受到抑制,细胞膜稳定性得以增强,从而提高了植株的抗逆能力。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 乙烯的生理作用及生物合成
• 1.1.1 乙烯的生理作用
• 1.2 乙烯信号转导
• 1.2.1 乙烯受体家族
• 1.2.2 CTR1
• 1.2.3 EIN2
• 1.2.4 乙烯反应元件及结合蛋白
• 1.2.5 EIN3基因及其编码蛋白的结构和功能
• 1.2.6 乙烯感受和信号转导的调控模式
• 1.3 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 番茄果实成熟度划分
• 2.1.3 菌株、质粒、试剂
• 2.1.4 常用试剂配制
• 2.1.4.1 提取质粒试剂
• 2.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳试剂
• 2.1.4.3 10×MOPS电泳缓冲液
• 2.1.4.4 番茄叶片基因组DNA提取试剂
• 2.1.4.5 番茄叶片基因组DNA的小量快速提取试剂
• 2.1.4.6 Southern杂交用试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 转基因番茄植株鉴定
• 2.2.1 PCR检测
• 2.2.1.1番茄叶片基因组DNA的小量快速提取
• 2.2.1.2 DNA片段的回收纯化
• 2.2.1.3 质粒DNA的小量提取-碱裂解法
• 2.2.1.4 引物的设计
• 2.2.1.5 25μl PCR反应体系及扩增条件
• 2.2.2 PCR检测呈阳性的植株Southern blot检测
• 2.2.2.1 番茄植株叶片总DNA的大量提取：CTAB法
• 2.2.2.2 植物基因组DNA的酶切
• 2.2.2.3 电泳及Southern转移
• 2.2.2.4 平衡膜
• 2.2.2.5 预杂交
• 2.2.2.6 随机引物法标记探针
• 2.2.2.7 杂交
• 2.2.2.8 洗膜
• 2.2.2.9 放射自显影
• 2.2.2.10 冲洗X光片
• 2.2.2.11 探针的去除
• 2.2.3 转反义LeEIL2基因番茄果实生理生化指标测定
• 2.2.3.1 番茄果实采后乙烯释放量测定
• 2.2.3.2 番茄果实采后呼吸速率测定
• 2.2.3.3 番茄果实硬度和可溶性固形物测定
• 2.2.3.4 番茄果实番茄红素含量测定
• 2.2.3.5 番茄果实多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性测定
• 2.2.3.6 番茄果实脂氧合酶（LOX）活性测定
• 2.2.3.7 番茄果实离体ACC氧化酶（ACO）活性测定
• 2.2.3.8 番茄果实ACC合成酶（ACS）活性测定
• 2.2.3.9 番茄果实ACC含量测定
• 2.2.3.10 番茄果实ABA、IAA、CTK含量测定
• 2.2.4 转反义LeEIL2基因番茄叶片生理生化指标测定
• 2.2.4.1 番茄植株叶片伤乙烯测定
• 2.2.4.2 番茄叶片膜透性测定
• 2.2.4.3 番茄植株叶片叶绿素含量的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 转基因植株鉴定
• 3.1.1 PCR检测
• 3.1.2 PCR检测呈阳性的植株Southern blot检测
• 3.2 转反义LEEIL2基因番茄果实生理生化指标测定
• 3.2.1 番茄果实采后乙烯释放量和呼吸速率测定
• 3.2.2 番茄果实硬度和可溶性固形物含量测定
• 3.2.3 番茄果实番茄红素含量测定
• 3.2.4 番茄果实PG和LOX活性测定
• 3.2.5 番茄果实ACO、ACS活性及ACC含量测定
• 3.2.6 番茄果实内源激素ABA、CTK、IAA含量测定
• 3.3 转反义LEEIL2基因番茄叶片生理生化指标测定
• 3.3.1 番茄植株叶片伤乙烯测定
• 3.3.2 番茄叶片电解质渗出率、叶绿素含量的变化
• 第四章 讨论
• 4.1 LEEIL2基因与乙烯、成熟衰老的相关性
• 4.2 转反义LEEIL2基因番茄果实采后生理生化特性的研究
• 4.2.1 果实采后乙烯释放量和呼吸速率的变化
• 4.2.2 果实硬度和可溶性固形物含量的变化
• 4.2.3 果实番茄红素含量的变化
• 4.2.4 果实PG和LOX活性的变化
• 4.2.5 果实ACO、ACS活性及ACC含量的变化
• 4.2.6 果实内源激素ABA、CTK、IAA含量的变化
• 4.3 转反义LEEIL2基因番茄离体叶片生理生化特性的研究
• 第五章 结论
• 5.1 具抗性转反义LeEIL2基因番茄植株的移栽种植及鉴定
• 5.2 转反义LeEIL2基因番茄植株果实采后生理特性研究
• 5.3 转反义LeEIL2基因番茄植株离体叶片生理特性研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简介