论文摘要
皮肤黑素瘤是一种恶性程度高、容易转移、死亡率高的恶性肿瘤,目前的治疗均以外科手术切除为主,结合化疗、生物制剂等辅助治疗,但常常不能控制肿瘤的发展和侵袭转移,而且化疗药物常有较大副作用,因此,探索疗效好而毒副作用较小的靶向治疗方法已成为当今的一个研究热点,而酪氨酸激酶c-abl与Wnt/β-catenin信号转导通路在靶向治疗的作用则倍受关注。近年的研究显示Wnt/β-catenin信号转导通路在黑素瘤中被激活,Wnt/β-catenin信号通路是细胞内重要的信号转导系统,联系着细胞外刺激信号与细胞内基因的转录调控,介导细胞的生长、发育、分化、增殖和凋亡,而c-abl能特异地将蛋白质底物上的某些酪氨酸残基磷酸化,在细胞内的信号转导中也十分重要,那么黑素瘤细胞中是否也存在c-abl异常表达,它是否参与了Wnt/β-catenin通路的信号转导,进而影响黑素瘤的生物学功能等问题目前尚未明确证实。本实验以正常黑素细胞及来自不同生长阶段的六种黑素瘤细胞系为研究对象,采用RT-PCR法和Western-blot法检测c-abl的表达水平;用伊马替尼抑制c-abl后观察黑素瘤细胞的生物学变化,并进一步研究c-abl对Wnt/β-catenin信号通路的影响及其机制。第一部分酪氨酸激酶c-abl在黑素瘤细胞中的表达及意义采用RT-PCR和Western-blot方法,检测了表皮正常黑素细胞、浅表扩散垂直生长期黑素瘤WM973B细胞及转移灶来源的黑素瘤细胞A2058（淋巴结）、WM-266-4（肿瘤皮肤转移灶）、Hs294T（淋巴结）、SK-MEL-5（淋巴结）、SK-MEL-1（胸导管淋巴液）中c-abl的表达情况,结果显示:在检测的7株细胞中c-abl mRNA除表皮正常黑素细胞中表达较弱外,其它黑素瘤细胞均高表达,表达强度在各株黑素瘤细胞之间无明显的差异。c-abl蛋白的表达与mRNA表达趋势基本一致,但是浅表扩散垂直生长期黑素瘤细胞的c-abl蛋白表达低于转移灶来源的黑素瘤细胞,呈现了动态变化的特征,从表皮正常黑素细胞、浅表扩散型黑素瘤细胞至转移性黑素瘤细胞,c-abl蛋白表达逐渐增强。由此推测c-abl可能参与黑素瘤的发生发展过程。第二部分酪氨酸激酶c-abl对黑素瘤细胞的生物学作用选择转移灶来源黑素瘤细胞Hs294T,实验采用MTT、平板克隆形成实验、流式细胞仪分析、细胞侵袭实验的方法,应用c-abl抑制剂甲磺酸伊马替尼作用于黑素瘤细胞后观察其生物学行为的改变,结果如下显示:1、MTT试验:实验所得吸光度值与活细胞数成正比,甲磺酸伊马替尼呈浓度依赖性地抑制Hs294T细胞的生长,其中0、4、8和10μmol/L四个浓度梯度处理细胞后吸光度值分别为566.6±10.4、517±14.8、458.9±13.7、420±12.2,具有显著性差异（P 0.05）。而10、16、20和24μmol/L四个浓度梯度细胞吸光度值分别为420±12.2、407.4±12.5、390.1±11.6、389.6±9.3,无明显差异（P 0.05）。在24h～72h,甲磺酸伊马替尼抑制了Hs294T细胞的生长,时间依赖性明显。2、平板克隆形成实验进一步验证了MTT实验结果,结果显示10μmol/L甲磺酸伊马替尼对黑素瘤细胞Hs294T的克隆形成有抑制作用,对照组和处理组克隆形成率分别为89.5±2.3%、53.5±3.4%,有显著性差异（P 0.05）;另外对照组细胞形成克隆的大小明显大于处理组。3、用FITC-AnnexinV- PI染色方法检测发现在10μmol/L的甲磺酸伊马替尼作用Hs294T细胞48h,抑制c-abl的活性后,与对照组相比,处理组凋亡细胞比例出现了明显增加。4、细胞基质胶侵袭实验结果发现对照组穿膜细胞数为73±11个/视野,5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理细胞24 h后,Hs294T细胞侵袭能力显著下降,穿膜细胞数为38±7个/视野,与对照组比较,差异具有统计学意义（P 0.05）。说明抑制c-abl的活性能抑制黑素瘤细胞生长增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞侵袭力。第三部分酪氨酸激酶c-abl对黑素瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响实验第二部分说明c-abl抑制剂能影响黑素瘤的生物学行为,为探讨其机制,我们应用激光共聚焦、荧光定量PCR、Western-blot的方法分析了黑素瘤细胞Hs294T中c-abl与Wnt信号通路间的关系,结果如下:1、激光共聚焦显微镜观察发现黑素瘤细胞中c-abl主要定位于细胞浆和细胞胲,与β-catenin蛋白亚细胞定位有较大比例的重合,由此推测它们可能存在着共定位和相互作用。当抑制c-abl活性后,β-catenin蛋白出现了一个从细胞浆、细胞核到细胞膜的亚细胞定位变化,但Western-blot结果发现β-catenin蛋白表达量却无明显变化。说明c-abl可能有促进β-catenin蛋白游离,进入细胞核的功能。2、进一步荧光定量PCR、Western-blot实验证实,抑制c-abl后Wnt通路转录分子LEF1 mRNA,靶基因cyclinD1蛋白、C-myc mRNA表达均明显下调。说明c-abl可能有上调Wnt通路的作用。综上所述,c-abl在黑素瘤的发生和发展中可能具有重要的作用,其高表达可能与黑素瘤的生长、增殖、凋亡、侵袭力等生物学功能存在相关性;c-abl抑制剂甲磺酸伊马替尼在体外能下调Wnt/β-catenin信号通路,抑制黑素瘤细胞的生长,提示该类c-abl抑制药物在黑素瘤的治疗中将可能发挥重要的作用,在黑素瘤分子靶向治疗中c-abl有望成为一个新的靶位。