论文摘要
目的随着眼科临床和基础研究的进步,白内障、角膜病等可得到有效控制和治疗,但一些致盲性视网膜疾患如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼视神经视网膜病变等采用目前的方法无法逆转。目前青光眼视神经保护的策略是在有效降低眼压的基础上,针对视神经损害的不同环节,利用不同的药物,保护患者视功能。此外,通过移植细胞使视网膜细胞更新是治疗神经变性疾病的另一种方法,逐渐受到关注。用于移植的细胞有脑源性神经干细胞、视网膜祖细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）等。本课题旨在探讨体外诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的可能性和条件,为青光眼视神经视网膜损害及其它视网膜退行性疾病的治疗提供种子细胞奠定实验基础。方法本课题选用大鼠骨髓间充质干细胞,根据其取材方便,便于体外扩增,可自身取材,来源丰富,免疫源性低等特性,对BMSCs进行体外诱导为神经元细胞进行研究。本研究包括2部分:1.大鼠BMSCs的培养和鉴定采用贴壁筛选法获得BMSCs,体外增殖纯化,获得纯化干细胞。流式细胞仪细胞鉴定。2.BMSCs经bFGF预诱导后,以β-巯基乙醇（β-BM）和视网膜匀浆上清液为诱导剂进行诱导。用倒置相差显微镜观察细胞形态,细胞免疫组织化学法检测诱导后各组细胞巢蛋白（Nestin）,神经丝蛋白（NF）,神经元特异烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等特异性标志物的表达。结果1.大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定（1）细胞分离培养通过贴壁法能获得纯度较高的BMSCs,原代培养3天后细胞呈纺锤形。7天后细胞呈团簇、集落状生长。细胞传代后,24h细胞大部分贴壁,传代后细胞增殖旺盛,仍呈梭形。传代过多细胞增殖减慢,可见到一些扁平,宽大的细胞。（2）流式细胞仪检测细胞表面标志表达CD90、CD29、CD44,不表达CD34、CD45、CD31。（3）多向分化潜能在含有诱导剂的培养基中,BMSCs可在体外分化成为成骨细胞、脂肪细胞。（4）10%血清浓度为BMSCs生长最佳浓度。（5）不同传代细胞增殖能力不同,P1和P3代细胞强于P8代细胞。2.体外神经分化（1）β-BM体外诱导BMSCs分化加入5 mmol/Lβ-BM1h左右开始细胞质向核收缩,胞体变小,变圆,透亮,并出现细胞突起,随时间延长部分细胞胞体收缩,细胞突起变细、变长,呈双极及多极,但数量不多。5h后更多细胞出现类神经细胞改变,细胞突起相互交织。少数细胞悬浮。诱导1h后Nestin阳性率高于NSE和NF,差异有显著性（P＜0.01）;诱导5h后Nestin阳性率低于NSE和NF,差异有显著性（P＜0.01）。NSE阳性率1h和5h,差异无显著性（P＞0.05）。Nestin:1h高于5h,差异有显著性（P＜0.01）。NF:1h低于5h,差异有显著性（P＜0.01）加入10 mmol/Lβ-BM诱导30 min左右细胞开始出现神经元细胞样形态,但较多细胞悬浮。诱导1h后阳性率NSE＞NF＞Nestin,差异有显著性（P＜0.001）,诱导5h后Nestin阳性率低于NSE和NF,差异有显著性（P＜0.01）。NSE和NF:阳性率1h低于5h（P＜0.01）,Nestin则相反。各组GFAP和对照组抗体染色阳性率在任何时间较其它抗体明显低,差异有显著性（P＜0.01）。（2）视网膜匀浆上清液诱导BMSCs向神经元细胞分化两组不同浓度视网膜匀浆上清液均能诱导BMSCs向神经细胞分化,与β-BM相比作用比较缓和,3天为分化高峰。诱导细胞存活时间1周以上。大鼠视网膜匀浆上清液诱导24h后,不同浓度组Nestin阳性率均明显高于NSE和NF,差异有显著性（P＜0.01）。诱导3d后Nestin抗体染色阳性细胞数量减少,大部分神经元样细胞NSE和NF染色阳性,差异有显著性（P＜0.01）。诱导7d后,Nestin抗体染色阳性细胞明显减少,大部分神经元样细胞NSE和NF染色阳性,差异有显著性（P＜0.01）。NSE与NF:诱导24h比3d和7d阳性细胞率低,差异有显著性（P＜0.01）。3d和7d差异无显著性（P＞0.05）。高浓度组阳性细胞率高,差异有显著性（P＜0.01）。Nestin:随诱导时间延长阳性率逐渐降低,各组差异均有显著性（P＜0.01）。高浓度组阳性细胞率高,差异有显著性（P＜0.01）。各组GFAP和对照组抗体染色阳性率在任何时间较其它抗体明显低,差异有显著性（P＜0.01）。结论1.β-BM在体外可诱导BMSCs分化为神经元样细胞,5mmol/L浓度为最佳浓度。诱导细胞早期表达神经干细胞标志物Nestin,以后表达成熟神经元标志物NF,NSE,不表达胶质细胞标志物GFAP。诱导细胞存活时间短。2.视网膜匀浆上清液可在体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞;诱导细胞表达标志物与β-BM诱导细胞相似。匀浆液作用缓和,细胞存活时间长,但分化率较低。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 诱导分化论文; 疏基乙醇论文; 视网膜匀浆上清液论文;