论文摘要
本实验提取了四川农业大学动物生物技术中心保存的Fa株、疫苗株783株、Bartha株和SA215株,四川野毒株SN株、SS株、SQ株、SL株和SCZ株,以及由韶关学院英东生物工程学院娄高明教授惠赠的北京BJ株、广东DG株、湖北HS株共计12株猪伪狂犬病病毒株的DNA并作为模板,应用PCR技术分别扩增得到了12条伪狂犬病毒完整的gC基因的片段。回收PCR产物,成功连接转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中,并通过菌落PCR和酶切鉴定正确后,送生物公司进行测序。将所得12条序列连同GenBank中登录的6条gC基因全序列共18条基因序列,使用生物软件对gC基因核苷酸序列的同源性、突变区域的定位、遗传进化关系、酶切位点的差异、密码子偏爱性、氨基酸序列的同源性、蛋白质亲水性、抗原表位分析、二级结构和三级结构预测等生物信息学内容进行分析。结果表明:PRV-gC基因的开放阅读框的核苷酸长度在1437bp～1464bp之间,氨基酸长度在478～487个之间,核苷酸同源性在94.9%～100%之间,氨基酸的同源性在90.2%～100%之间;在核酸175～222位存在高变缺失区,其中共有8个碱基突变和21个碱基的插入或缺失;在遗传进化关系上,四川地区流行的毒株与日本、欧美毒株有较近的亲缘关系,而我国其它地区的毒株间的遗传相关性较高,但与日本、欧美洲毒株亲缘关系较远;在18条PRV-gC基因核苷酸序列中均没有发现HindⅢ酶切位点,同时Fa株、DG株、SA215株、BJ株、Min A株和Ea株也没有BamHⅠ位点,Yamagata S-81株则没有SalⅠ位点,其它酶切位点出现的次数和位置都有细小差异;而不同PRV毒株gC基因均对G、C有明显的偏爱性。在蛋白质疏水性、抗原表位和二、三级结构的预测方面,不同毒株间具有相似性,但仍表现出一定程度的差异。
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摘要Abstract文献综述一、猪伪狂犬病的概况1 流行病学2 病原2.1 伪狂犬病病毒的主要理化和生物学特性2.2 伪狂犬病病毒的分子生物学特性2.2.1 伪狂犬病病毒的基因组2.2.2 伪狂犬病病毒的蛋白及其功能3 临床症状4 病理变化5 诊断5.1 血清学诊断技术5.2 分子生物学诊断技术5.2.1 核酸探针诊断技术5.2.2 PCR技术6 防制二、gC基因概况1 gC基因的功能1.1 病毒吸附方面1.2 影响病毒的释放和病毒粒子的稳定性1.3 影响毒力2 gC的免疫学意义3 相关PRV新型疫苗研究4 生物信息学在病毒研究中的作用4.1 通过多重序列对齐搜寻保守序列4.2 通过数量关系的优化推导敏感位点4.3 通过同源建模预测序列的高级结构三、实验目的和意义材料与方法1 材料1.1 细胞、毒株、载体和菌株1.2 主要试剂及其配制1.3 主要仪器2 方法2.1 病毒基因组DNA的抽提2.1.1 PRV病毒的细胞增殖2.1.2 病毒基因组DNA的抽提2.2 PRV-gC基因的PCR扩增2.2.1 引物的设计与合成2.2.2 gC基因的PCR扩增2.3 PRV-gC基因的克隆2.3.1 PCR产物目的DNA片段的回收2.3.2 质粒载体的准备2.3.3 连接2.3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备2.3.5 重组质粒的转化2.4 重组质粒的鉴定2.4.1 菌落PCR法鉴定2.4.2 酶切鉴定2.5 gC基因的序列测定2.6 gC基因的序列分析2.6.1 PRV-gC基因序列的汇总2.6.2 PRV-gC基因核苷酸序列分析2.6.3 PRV-gC基因氨基酸序列分析结果1 PRV-gC基因的PCR扩增2 PRV-gC基因的克隆2.1 重组质粒菌落PCR法鉴定2.2 重组质粒的双酶切鉴定3 序列测定4 序列分析4.1 PRV-gC基因序列汇总4.2 PRV-gC基因核苷酸序列分析4.2.1 PRV-gC基因核苷酸序列同源性分析4.2.2 PRV-gC基因核苷酸高变缺失序列分析4.2.3 PRV-gC基因核苷酸序列遗传进化树分析4.2.4 PRV-gC基因核苷酸序列酶切位点分析4.2.5 PRV-gC基因核苷酸序列密码子偏爱性分析4.3 PRV-gC基因氨基酸序列分析4.3.1 PRV-gC基因氨基酸序列同源性分析4.3.2 PRV-gC蛋白抗原性预测分析4.3.3 PRV-gC蛋白高级结构预测讨论1 关于伪狂犬病病毒gC基因的克隆2 关于PRV-gC基因的核苷酸序列分析3 关于gC基因变异与抗原性的关系4 关于PRV-gC蛋白高级结构的预测和分析结论参考文献致谢
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