一株番茄不孕病毒全基因组序列与侵染性克隆研究

论文摘要

番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus,TAV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员,该属病毒还包括花生矮化病毒（Peanut stunt virus,PSV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）。TAV为三分体单链正义RNA（+ssRNA）病毒,根据其序列由大到小分别命名为RNA1、RNA2和RNA3。TAV主要通过突变、重组和假重组等方式进行变异和进化,使之能够不断适应新的环境和新的寄主。TAV的寄主十分广泛,可侵染包括藜科、茄科等在内的24个双子叶家族和3个单子叶家族的100多个品种,是最具有经济重要性的植物病毒之一。本研究TAV病毒分离自北京郊区自然感病的番茄样品,定名为TAV-BJ。通过寄主生物学实验,双链RNA（dsRNA）抽提检测,病毒粒子及其病毒基因组RNA提取,Northern杂交等方法对TAV-BJ进行了生物学检测。通过对感病叶组织进行总RNA提取、RT-PCR扩增和克隆测序,获得了TAV-BJ全序列信息,并登录到GenBank数据库。TAV-BJ RNA1全长为3409nt,内含1a ORF（963077）,编码994个氨基酸的1a蛋白。RNA2全长为3023nt,包含2个ORF。其中2a ORF（882574）编码829个氨基酸的2a蛋白。2b ORF（ 24472680 ）的5’端与2a ORF的3’端重叠,编码78个氨基酸的2b蛋白。RNA3全长为2218nt,包含2个ORF。其中3a ORF（192932）编码247个氨基酸的3a蛋白,CP ORF（12271883）编码219个氨基酸的CP蛋白。将TAV-BJ与仅有的2株获得全序列的TAV株系（KC和V株系）各亚基因组片段、ORF及其编码的蛋白的序列同源性进行比较。从三条RNA序列来看,TAV-BJ RNA1和RNA2与其他两个株系序列同源性高达98.6%左右。而对于RNA3,TAV-BJ与KC株系序列同源性达到了99.1%,与V株系的序列同源性更高达99.6%。5个ORF的核苷酸序列同源性比较结果与三条亚基因组比较结果也表现出高度的同源性。这一结果说明,TAV株系间具有非常高的同源性。在获得TAV-BJ全序列信息的基础上,通过RT-PCR方法在TAV-BJ全长cDNA的5’端引入T7启动子和酶切位点,克隆进pUC18载体,成功地构建了TAV-BJ三条全长序列侵染性克隆质粒。同时通过重叠PCR的方法获得2b蛋白缺失的TAV-BJ RNA2（T2△2b）,并构建得到侵染性克隆质粒。pT1、pT2、pT3和pT2△2b分别对应于TAV-BJ RNA1、RNA2,RNA3和RNA2△2b侵染性克隆质粒,体外转录获得相应的RNA转录本,并通过寄主实验证明它们的侵染活性。CMV-Fny△2 b,由于其基因沉默抑制子2b蛋白的缺失,从而无法抵御植物对外源RNA的基因沉默,因此其侵染寄主无病理症状。将T1,T2,T3和T2△2b分别与CMV-Fny△2 b混合接种寄主,结果显示含T2和T3的重组病毒使寄主表现出病理症状。因为TAV 2b是基因沉默抑制子,能够一定程度上弥补重组病毒中CMV-Fny 2b蛋白缺失情况下的抗基因沉默功能,因此T3中可能存在同T2中2b蛋白功能相似的蛋白。通过重叠PCR的方法,分别构建以Fny 3a和CP基因片段替换TAV 3a和CP基因片段的TAV RNA3嵌合体侵染性克隆质粒,分别命名为pT3F3a和pT3FCP。CMV-Fny RNA1和CMV-Fny RNA2△2b的侵染性转录本分别与T3F3a和T3FCP转录本混合后接种寄主。结果显示,含TAV 3a基因的序列片段嵌合体病毒T3Fcp能够有效弥补CMV-Fny缺失2b基因情况下重组病毒的侵染活性,因此推测TAV 3a蛋白很可能与2b一样也具有抑制基因沉默的功能。为了进一步确定候选蛋白的基因沉默抑制子功能,本研究还进行了瞬时表达-农杆菌共浸润实验。本研究构建了含TAV-BJ 2b和3a基因的瞬时表达载体（35S-T2b和35S-T3a）,将其导化入农杆菌,与能够诱导绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein ,GFP）系统沉默的的35S-GFP农杆菌共浸润转GFP基因本氏烟16c。浸润后3天,在长紫外灯下,35S-GFP和35S-T2b或35S-T3a农杆菌共浸润区还保持亮绿（GFP表达）,而35S-GFP浸润区为暗红（无GFP表达）。CMV-Fny的2b和3a基因瞬时表达载体（35S-F2b和35S-F3a）作为对照,其浸润结果显示,浸润后3天,在长紫外灯下,35S-F2b和35S-GFP农杆菌共浸润区还保持亮绿,而35S-F3a和35S-GFP农杆菌共浸润区为暗红。这些结果说明TAV 3a蛋白和2b蛋白的存在抑制了寄主的局部转录后基因沉默,使GFP在寄主体内顺利表达。由此初步确定TAV 3a蛋白是TAV中除2b蛋白外第二个基因沉默抑制子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 番茄不孕病毒的侵染特性
• 1.2 番茄不孕病毒结构、基因组功能及其形态
• 1.2.1 番茄不孕病毒的结构和基因组功能
• 1.2.2 番茄不孕病毒的形态
• 1.3 番茄不孕病毒全序列测定及功能蛋白研究
• 1.3.1 全序列测定
• 1.3.2 主要功能蛋白研究
• 1.4 番茄不孕病毒突变、重组研究进展
• 1.4.1 番茄不孕病毒的突变研究
• 1.4.2 番茄不孕病毒的重组与突变研究
• 1.5 番茄不孕病毒侵染性克隆构建研究进展
• 1.6 基因沉默和基因沉默抑制子
• 1.7 本文的研究目的与意义
• 1.7.1 研究的目的与意义
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 番茄不孕病毒BJ 株系生物检测和全基因组序列测定
• 2.1 TAV-BJ 生物学检测的材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 病理学症状观察
• 2.1.3 双链RNA 大量抽提
• 2.1.4 病毒粒子提取
• 2.1.5 从病毒粒子中提取基因组
• 2.1.6 Northern 杂交
• 2.2 TAV-BJ 全基因组序列测定的材料与方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 载体与试剂
• 2.2.3 毒源
• 2.2.4 总RNA 提取
• 2.2.5 RT-PCR 扩增
• 2.2.6 PCR 产物回收
• 2.2.7 DNA 片段的连接
• 2.2.8 重组质粒的转化
• 2.2.9 重组质粒筛选
• 2.2.10 酶切鉴定阳性质粒
• 2.2.11 PCR 鉴定阳性质粒
• 2.2.12 重组克隆序列测定与拼接
• 2.2.13 全序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TAV-BJ 病理学症状观察结果
• 2.3.2 TAV-BJ 的分子检测结果
• 2.3.3 TAV-BJ 全序列克隆结果
• 2.3.4 全序列分析和同源性比较
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 番茄不孕病毒BJ 株系侵染性克隆构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毒源、酶和试剂
• 3.1.2 引物设计
• 3.1.3 侵染性克隆质粒构建过程
• 3.1.4 体外转录
• 3.1.5 接种
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 侵染性克隆质粒构建结果
• 3.2.2 体外转录产物接种心叶烟后的症状反应
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 番茄不孕病毒 BJ 株系 3a 蛋白基因沉默抑制功能初步确定
• 4.1 TAV RNA3 嵌合体侵染性克隆的材料与方法
• 4.1.1 毒源、酶与试剂
• 4.1.2 重叠 PCR 引物设计
• 4.1.3 重叠PCR 扩增
• 4.1.4 侵染性克隆质粒构建
• 4.1.5 体外转录与重组病毒接种
• 4.2 瞬时表达-农杆菌共浸润实验的材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 瞬时表达载体构建
• 4.2.3 农杆菌电转化感受态的制备
• 4.2.4 瞬时表达载体的农杆菌转化
• 4.2.5 农杆菌的共浸润
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 TAV RNA3 嵌合体侵染性克隆质粒构建结果
• 4.3.2 嵌合重组病毒接种心叶烟后的症状反应
• 4.3.3 瞬时表达载体构建结果
• 4.3.4 瞬时表达载体影响转GFP 基因本生烟16c 的GFP 沉默成像结果
• 4.4 小结与讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录：重要溶液的配制
• 致谢
• 攻读硕士期间的研究成果