荷叶生物碱的分析及其体内药代动力学研究

论文摘要

荷叶（Folium Nelumbinis）是睡莲科植物莲的叶片,在我国大部分地区都有广泛种植,是极具开发价值的药食两用植物。生物碱是荷叶中最主要的活性成分之一,虽然含量甚微,但其在降脂减肥、抑菌、抗病毒以及镇静、抗惊厥方面均有显著的生物活性。目前对生物碱的研究大多集中在化学成分提取分离、含量测定上,也有关于总碱或荷叶碱药理方面的报道,其他研究则鲜有涉及。本文对荷叶生物碱进行了较为系统的研究,包括荷叶总生物碱的提取纯化；总碱中主要成分的分离鉴定;不同来源荷叶生物碱的含量测定；主要生物碱在大鼠血浆和脑中的药代动力学研究,从而为荷叶资源的进一步开发和应用提供科学依据。主要研究内容和结果如下：1.荷叶生物碱的提取及分离 以湖南产荷叶为原料,首先对总生物碱的提取条件进行优化,分别对盐酸浓度、溶剂量、提取次数、提取时间四因素进行L9（34）正交实验考察,进一步比较了四种阳离子交换树脂XSI-004、XSI-008、D001、D113的纯化效果,最终确定总生物碱的最佳提取纯化工艺为：以30倍的0.2%HCl水溶液为提取溶剂,提取3次,每次3小时。提取液经D001型阳离子交换树脂纯化得到总生物碱,得率为10.9 g/kg生药。进一步利用反相硅胶柱层析和高效液相制备色谱法分离得到两种单体化合物,HPLC归一化法检测纯度均大于97%,且经过质谱、核磁共振碳谱、氢谱进行结构鉴定。将获得的光谱数据与已有文献对照,确定所分得的化合物分别为2-羟基-1-甲氧基阿朴啡（2-hydroxy-1-methoxyaporphine, HMA）及N-去甲荷叶碱（N-nornuciferine,N-NF）。2.不同产地和不同采收期荷叶生物碱的成分比较 建立同时测定HMA、N-NF、及荷叶碱（Nuciferine, NF）三种生物碱含量的高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）检测方法,并比较了来自湖南、湖北、浙江、陕西、贵州、北京6个区域和北京6-10月间连续5个月采收的荷叶中这三种成分的含量变化。样品以含0.2%盐酸的70%甲醇为溶剂,利用超声辅助进行提取,选用Agilent Extend-C18柱,以乙腈-含0.1%三乙胺的水溶液为流动相进行梯度洗脱,实现HMA、N-NF和NF同时基线分离。结果显示三个化合物在相应的浓度范围内具有良好的线性关系,所建立的HPLC方法准确可靠,具有良好的精密度、重现性及回收率,可用于荷叶生物碱的含量测定。含量比较发现不同产地荷叶样品中生物碱的含量差别明显,其中以浙江产荷叶中总生物碱的含量最高,贵州、湖南次之。同一产地荷叶中以荷叶碱的含量最高。不同采收期的荷叶生物碱含量比较发现,随着生长期的延长,NF和N-NF含量逐渐降低,而HMA的含量逐渐升高,提示生物碱成分之间可能存在一定的生物转化。该研究为筛选荷叶的优良产地和采收时间提供参考。3.荷叶生物碱在大鼠血浆中的药代动力学研究 建立UPLC检测方法,对N-NF和NF在大鼠血中的药代动力学和口服生物利用度进行研究。SD雄性大鼠分别口服（50mg/kg）和静脉（10mg/kg）给予荷叶总生物碱提取物（NF约45%,N-NF为20%）,采用乙酸乙酯液-液萃取法对不同时间点血浆样品进行处理。选用Thermo SyncronisC18柱,以乙腈和含0.05%三乙胺水溶液为流动相进行梯度洗脱。应用WinNonlin 6.2软件以非房室模型计算主要药动学参数和绝对生物利用度。结果显示血浆中NF和N-NF均在10～200 ng/mL和200～5000 ng/mL两个浓度范围内呈现良好的线性关系,UPLC分析方法灵敏、准确可靠。N-NF和NF在血浆中的药物浓度-时间曲线基本一致,药动学参数接近,相比之下,NF在体内的吸收和消除速度均比N-NF快,具有较好的生物利用度（58.13%）,而N-NF吸收程度更好,生物利用度高达79.91%。4.荷叶生物碱在大鼠脑内的药代动力学研究 本研究通过脑微透析技术和超高效液相（UPLC）检测方法联用,首次探讨静脉给予荷叶总碱提取物后游离型药物在大鼠脑内的药代动力学特性。将脑微透析探针植入大鼠侧脑室,以2μL/min的流速向透析管灌流含5 mMβ-环糊精的人工脑脊液,对SD大鼠静脉给予荷叶总碱提取物（20mg/kg）后,在不同时间间隔收集透析液进行检测,通过测定探针回收率计算脑脊液中真实药物浓度。结果表明在大鼠脑内能检测到较高的游离N-NF和NF,且它们的浓度随时间的变化趋势基本一致,由此说明它们能够透过血脑屏障进入脑部,推测N-NF和NF很可能是发挥神经活性的有效成分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 荷叶的化学成分
• 1.1.1 生物碱类
• 1.1.2 黄酮类
• 1.1.3 挥发油
• 1.2 荷叶资源的应用
• 1.2.1 食品上的应用
• 1.2.2 临床上的应用
• 1.2.3 其他方面应用
• 1.3 荷叶生物碱的提取和分离纯化方法
• 1.3.1 提取方法
• 1.3.2 分离纯化方法
• 1.4 阿朴啡类生物碱的生物活性及药代动力学研究进展
• 1.4.1 阿朴啡类生物碱的生物活性
• 1.4.2 药代动力学研究进展
• 1.5 微透析技术
• 1.6 本论文研究的目的、意义及内容
• 2 材料与方法
• 2.1 仪器设备
• 2.2 材料与试剂
• 2.3 实验动物
• 2.4 荷叶生物碱的提取及分离
• 2.4.1 荷叶生物碱的提取分离工艺路线
• 2.4.2 HPLC色谱方法用于荷叶生物碱的检测
• 2.4.3 荷叶生物碱提取工艺研究
• 2.4.4 荷叶生物碱的纯化工艺研究
• 2.4.5 荷叶总生物碱的制备
• 2.4.6 荷叶生物碱单体分离及结构鉴定
• 2.4.7 荷叶总生物碱中三个单体的含量分析
• 2.5 不同产地和不同采收期荷叶生物碱的成分比较
• 2.5.1 对照品溶液的制备
• 2.5.2 检测波长的选择
• 2.5.3 提取溶剂的选择
• 2.5.4 提取时间的选择
• 2.5.5 供试品溶液的制备
• 2.5.6 方法学考察
• 2.5.7 样品含量测定
• 2.6 荷叶生物碱在大鼠血浆中的药代动力学研究
• 2.6.1 标准品溶液和内标溶液的配制
• 2.6.2 标准血浆样品和质控样品的配制
• 2.6.3 血浆样品处理
• 2.6.4 色谱条件
• 2.6.5 方法学验证
• 2.6.6 药代动力学实验
• 2.7 荷叶生物碱在大鼠脑内的药代动力学研究
• 2.7.1 人工脑脊液的配制
• 2.7.2 探针的使用方法
• 2.7.3 体内微透析试验
• 3 结果与讨论
• 3.1 荷叶生物碱的提取及分离
• 3.1.1 荷叶生物碱提取溶剂的选择
• 3.1.2 荷叶生物碱提取的正交试验结果
• 3.1.3 树脂筛选结果
• 3.1.4 荷叶总生物碱制备得率
• 3.1.5 生物碱成分结构鉴定
• 3.1.6 荷叶总碱中单体的含量分析
• 3.2 不同产地和不同采收期荷叶生物碱的成分比较
• 3.2.1 生物碱吸收波长的确定
• 3.2.2 色谱条件的确定
• 3.2.3 样品提取溶剂的确定
• 3.2.4 样品提取时间的确定
• 3.2.5 方法学考察
• 3.2.6 荷叶样品中生物碱含量
• 3.3 荷叶生物碱在大鼠血浆中的药代动力学研究
• 3.3.1 方法专属性
• 3.3.2 线性及最低定量限
• 3.3.3 精密度和准确度
• 3.3.4 提取回收率
• 3.3.5 稳定性
• 3.3.6 内标的选择依据
• 3.3.7 血浆样品处理方法的选择
• 3.3.8 药物配制时溶媒的选择
• 3.3.9 药动学研究
• 3.4 荷叶生物碱在大鼠脑内的药代动力学研究
• 3.4.1 不同灌流液下探针回收率的比较
• 3.4.2 灌流液流速及取样时间的确定
• 3.4.3 脑局部药动学研究
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 获奖情况
• 9 致谢