盾壳霉高渗相关基因的克隆及β-葡萄糖苷酶基因的初步研究

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重要寄生真菌,对核盘菌的菌核和菌丝均具有寄生和破坏作用,是作物菌核病的重要生防菌。前期的研究表明将盾壳霉分生孢子于油菜初花期喷施到油菜地上部分可以较好地控制油菜菌核病；将盾壳霉分生孢子施用于土壤中也可以有效地降低土壤中的菌核数量,抑制菌核的萌发。菌核是一种休眠结构,渗透势高,盾壳霉侵入并从其中获得营养物质需要克服菌核高渗透势的影响,因此,提高盾壳霉耐高渗的能力,有可能促进盾壳霉寄生和腐烂菌核。为了研究盾壳霉的分子生物学特性,从中筛选和克隆相关功能基因,我们实验室以菌株ZS-1为材料,建立了农杆菌介导的遗传转化技术及其T-DNA插入体库。本研究以蔗糖为材料配制了高渗培养基,在盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA标记插入突变体库中筛选到的六株高渗相关的突变体,并利用反向PCR和hi-TALL PCR等技术对这些突变体的相关基因进行克隆。其中突变体TN542中T-DNA插入破坏了与β-葡萄糖苷酶前体具有很高的同源性的基因,命名为BGL-Like,以此突变体为材料进行相关研究。突变体TN542与菌株ZS-1相比,在PDA上,20℃条件下培养10天,两者的生长速度、产孢量、菌落形态、菌丝尖端和分生孢子的形态等方面没显著性差异；但是在含1.2M的蔗糖培养基上,突变体ZS-1TN542的生长速度明显大于菌株ZS-1,因此,该突变体具有耐高渗的特性。为了确定突变体的这种特性,将突变体TN542和ZS-1菌株分别置于含1M山梨醇和1MNaCI培养基,突变体TN542的生长速度明显大于菌株ZS-1,且随着培养时间的延长,两者之间的差异性越显著；在高渗透势的环境下,突变体TN542寄生核盘菌菌核的能力高于菌株ZS-1。Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1TN542中为单位点插入,结合盾壳霉的全基因组序列分析BGL-Like基因全长1565 bp,含有3个内含子区域,T-DNA的插入在翻译起始位点上游1300bp的区域。通过RT-PCR实验表明该基因在突变体TN542中表达量高于菌株ZS-1,结合生物学软件分析,推测该序列的前20个碱基是个信号肽,T-DNA可能插入在启动子区域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌的研究进展
• 1.1 核盘菌极其危害
• 1.2 作物菌核病的防治
• 2 盾壳霉的研究进展
• 2.1 盾壳霉生物学特性
• 2.2 盾壳霉的生态学特性
• 2.3 盾壳霉分子生物学研究
• 3 高渗特性研究进展
• 3.1 高等植物中高渗特性研究
• 3.2 微生物中高渗特性研究
• 4 B-1.3葡萄糖苷酶的研究进展
• 5 研究目的及意义
• 第二章 高渗相关突变体的筛选及相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 抗生素及其他试剂
• 1.1.4 酶类、试剂盒及其它试剂
• 1.1.5 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 高渗相关突变体的筛选、继代验证及保存
• 1.2.2 筛选获得的突变体菌株DNA的提取
• 1.2.3 筛选获得的菌株分子验证
• 1.2.4 反向PCR和hiTAIL-PCR克隆突变体T-DNA两侧翼的序列
• 1.2.5 PCR产物的纯化和回收
• 1.2.6 PCR产物与T-载体连接
• 1.2.7 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物
• 1.2.8 重组质粒的筛选及PCR鉴定
• 1.2.9 克隆序列的分析
• 2 结果与分析
• 2.1 突变体的保存与筛选
• 2.2 筛选获得的突变体分子验证
• 2.3 筛选获得的突变体中T-DNA插入位点侧端的DNA序列
• 2.4 高渗相关基因的生物信息学分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 盾壳霉突变体TN542的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 Southern杂交用试剂
• 1.1.4 其他的溶液及试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 ZS-1和TN542菌株的生物学特性观察
• 1.2.2 ZS-1和TN542菌株抗生物质的检测
• 1.2.3 ZS-1和TN542菌株寄生菌核的能力测定
• 1.2.4 ZS-1和TN542菌株在高渗条件下生长态势
• 1.2.5 温度对ZS-1和TN542菌株的生长态势的影响
• 1.2.6 高温高渗对ZS-1和TN542菌株的态势的影响
• 1.2.7 Southern杂交验证突变体TN542中T-DNA插入拷贝数
• 1.2.7.2 突变体TN542基因组DNA的酶切、电泳、转膜及固定
• 1.2.7.3 预杂交
• 1.2.7.4 制备探针及探针标记
• 1.2.7.5 杂交、洗膜及压片
• 1.2.8 RT-PCR验证TN542中BGL-Like基因的表达情况
• 1.2.8.1 菌株ZS-1和TN542中总RNA的提取
• 1.2.8.2 mRNA反转录合成cDNA
• 1.2.8.3 cDNA第二链的合成及电泳检测
• 2 结果与分析
• 2.1 基因BGL-Like的生物学信息分析
• 2.2 ZS-1和突变体TN542菌株菌落形态的观察
• 2.3 ZS-1和突变体TN542菌株菌丝尖端的观察
• 2.4 ZS-1和突变体TN542菌株生长速度测定
• 2.5 ZS.1和突变体TN542菌分生孢子产量的测定
• 2.6 ZS-1和突变体TN542菌株分生孢子形态观察
• 2.7 ZS-1和突变体TN542菌株抗细菌能力测定
• 2.8 ZS-1和突变体TN542菌株抗真菌物质能力测定
• 2.9 ZS-1和突变体TN542菌株寄生菌核的能力测定
• 2.10 ZS-1和突变体TN542菌株高渗培养上生长特性观察
• 2.10.1 1M山梨醇培养基上生长特性
• 2.10.2 1M NaCl培养基上生长特性
• 2.11 温度对ZS-1和突变体TN542菌株生长的影响
• 2.12 高温高渗对ZS-1和突变体TN542菌株生长的影响
• 2.13 Southern杂交验证突变体TN542中T-DNA插入拷贝数
• 2.14 RT-PCR验证TN542中BGL-Like基因的表达
• 3. 结论和讨论
• 展望
• 参考文献
• 致谢