诺如病毒衣壳蛋白的原核表达与抗血清的制备

论文摘要

诺如病毒（Norovirus,NV）是目前继轮状病毒后,致使人类非细菌性腹泻的第二大病原。人类主要通过被污染的食物摄入诺如病毒,而在被污染的食物中牡蛎占了主要部分。诺如病毒作为一种食源性腹泻病毒首先在美国被发现后,世界各地相继出现了有关诺如病毒的报道。近些年,世界各地相继爆发了大规模的诺如病毒引起的急性肠胃炎疫情,许多国家已对我国进出口水产品中诺如病毒的检测提出要求,因此,对诺如病毒的检测已不能仅仅局限于原来的实验室复杂、繁琐的检测,快速、经济且适用于大量样品的检测的方法的研究已日趋重要。但目前,世界上还没有一种快速、有效且价格低廉的诺如病毒检测试剂盒。诺如病毒变异性大,检测困难,但利用原核表达的诺如病毒衣壳蛋白,其特异性保守的11个氨基酸可以很好的展示在外,利用这种蛋白免疫动物,可以获得具有广泛识别能力的抗血清,该抗血清可以从一定程度上解决诺如病毒变异性强、难于检测的缺点。本实验通过大肠杆菌表达诺如病毒衣壳蛋白,并制备抗血清,为诺如病毒的快速酶联免疫检测试剂盒的建立奠定了一定的基础。具体研究结果如下:1、通过Trizol法提取样品中的RNA,通过对诺如病毒RNA聚合酶基因片段（特异性保守区域）的RT-PCR扩增与测序得到该基因片段的核苷酸序列,该核苷酸序列长301个碱基,通过对序列用DNA Star Megline、MEGA软件进行分析和通过NCBI网站进行在线BLASTN分析,确定该病毒株为NV GⅡ型。2、由于NV GⅡ-3型与NV GⅡ-4型,都是我国流行病毒株型,且具有很高的同源性因此,因此本实验后期通过对GⅡ-4、GⅡ-3型病毒代表株衣壳蛋白基因同源性比较,设计简并引物对分离病毒株衣壳蛋白基因进行PCR扩增,结果显示,只有GⅡ-3简并引物可以扩增出特异性目的带。将PCR扩增产物进行基因测序与序列分析表明该病毒株衣壳蛋白基因共1647个碱基,与GⅡ-3型病毒代表株衣壳蛋白基因长度相同,通过对该病毒株衣壳蛋白基因与GⅡ-3、GⅡ-4代表株的同源区域相似性比较,得出,该病毒株衣壳蛋白基因与NV GⅡ-3型的同源相似性大于NV GⅡ-4型。3、用DNAtools对衣壳蛋白基因进行分析发现,在衣壳蛋白基因在扩增过程中未产生终止密码子突变,可用于表达,此外,在该衣壳蛋白氨基酸序列N末端,含有YODA提出的11个氨基酸保守区域QQNIIDPWIMN,该区域位于诺如病毒衣壳蛋白抗原表位,为NV GI、GII型共有。4、将衣壳蛋白基因插入表达载体pQE30,构建重组质粒,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析分离纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE电泳判断出该衣壳蛋白大小约60kDa。5、将纯化的衣壳蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并通过间接ELISA方法对抗血清效价进行测定。结果表明该抗血清效价可达到1:10000,符合酶联免疫检测的要求。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 病毒的归类
• 1.2 病毒的分类
• 1.2.1 形态学分类
• 1.2.2 血清型分类
• 1.2.3 基因组型分类
• 1.3 病毒的变异性
• 1.4 病毒的培养
• 1.5 病毒宿主
• 1.6 病毒的流行性
• 1.6.1 传染源与传播途径
• 1.6.2 临床症状
• 1.6.3 感染率
• 1.7 诺如病毒的检测方法
• 1.8 诺如病毒衣壳蛋白的体外表达技术
• 1.9 论文的研究目的
• 1.10 技术路线
• 参考文献
• 2 诺如病毒阳性样品的筛选与RNA 聚合酶基因片段的分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液及培养基的配制
• 2.1.4 主要设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基础实验操作
• 2.2.2 样品的前处理
• 2.2.3 样品中RNA 的提取
• 2.2.4 逆转录合成cDNA
• 2.2.5 RNA 聚合酶基因片段的PCR 扩增
• 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 1的构建'>2.2.7 重组质粒pT-NV₁的构建
• 1转化大肠杆菌DH5α'>2.2.8 重组质粒pT-NV₁转化大肠杆菌DH5α
• 2.2.9 蓝白斑筛选
• 2.2.10 重组质粒的提取
• 2.2.11 酶切检测
• 2.2.12 测序
• 2.3 结果
• 2.3.1 RNA 聚合酶基因片段的PCR 扩增产物
• 2.3.2 PCR 产物的序列分析
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 3 诺如病毒衣壳蛋白的原核表达与鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验样品
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液及培养基的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 基础实验操作
• 3.2.2 引物的设计
• 3.2.3 衣壳蛋白基因的PCR 扩增
• 2的构建'>3.2.4 重组质粒pT-NV₂的构建
• 2转化大肠杆菌DH5α'>3.2.5 重组质粒pT-NV₂转化大肠杆菌DH5α
• 3.2.6 酶切检测
• 3.2.7 测序与序列分析
• 2的构建'>3.2.8 重组质粒pQE30-NV₂的构建
• 3.2.9 大肠杆菌M15 感受态细胞的制备
• 2转化大肠杆菌M15'>3.2.10 重组质粒pQE30-NV₂转化大肠杆菌M15
• 3.2.11 酶切检测
• 3.2.12 NV 衣壳蛋白基因的诱导表达
• 3.2.13 Ni-NTA 亲和层析对表达蛋白的纯化与验证
• 3.2.14 不同pH 值洗脱液的SDS-PAGE 电泳对Ni-NTA 纯化效果的验证
• 3.3 结果
• 3.3.1 NV 衣壳蛋白基因序列的扩增结果
• 3.3.2 衣壳蛋白基因核苷酸序列的分析
• 3.2.3 NV 衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 4 诺如病毒GII 型衣壳蛋白抗血清的制备与效价的ELISA 检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验样品
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要溶液的配制
• 4.1.4 实验用兔
• 4.1.5 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 基础实验操作
• 4.2.2 免疫原的制备
• 4.2.3 兔抗血清的制备
• 4.2.4 抗体的检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 包被蛋白与酶标二抗的最佳反应浓度的确定
• 4.3.2 兔抗血清效价的ELISA 检测结果
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 总结
• 致谢
• 发表的学术论文