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SiRNA沉默TGF-βRII及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

论文摘要

目的研究SiRNA沉默TGF-βRⅡ对体外培养人瘢痕成纤维细胞增殖的影响及诱导的成纤维细胞凋亡,为临床增生性瘢痕的防治提供科学的实验依据。方法用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencerTM3.1-H1neo vector中,构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3。脂质体介导转染人原代成纤维细胞,经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。实验采用MTT检测SiRNA沉默TGF-βRⅡ对体外培养人瘢痕成纤维细胞增殖的影响,通过Giemsa染色、流式细胞仪及基因组DNA电泳检测SiRNA沉默TGF-βRⅡ诱导的成纤维细胞凋亡。结果3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Western blotting均证实:3种shRNA重组质粒中pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA丰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。选择采用pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA2作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞24h、48h、72h后,可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,并出现成纤维细胞突出变短、变少,胞核、胞质浓缩,染色质边集,呈现典型的凋亡细胞形态;流式细胞仪检测瘢痕成纤维细胞凋亡率为18.4%,与对照组比较,差异有显著性:1.5%琼脂糖电泳结果出现DNA梯子,以作用48小时最为明显。结论成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。在增生性瘢痕成纤维细胞生长融合后早期,SiRNA沉默TGF-βRⅡ表达对其增殖具有明显抑制作用。在瘢痕成纤维细胞生长融合后早期,SiRNA沉默TGF-βRⅡ表达可诱导体外培养的瘢痕成纤维细胞凋亡。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 前言
  • TM3.1-H1载体的构建'>第一部分 表达人TGF-B RⅡ SIRNA的PSILENCERTM3.1-H1载体的构建
  • 1 材料与方法
  • 1.1 主要试剂
  • 1.2 主要仪器设备
  • 1.3 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 双酶切结果
  • 2.2 测序结果分析
  • 3.讨论
  • 4.小结
  • 第二部分 SIRNA沉默TGF-B RⅡ表达对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响
  • 1 材料与方法
  • 1.1 主要试剂
  • 1.2 主要仪器设备
  • 1.3 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 人增生性瘢痕成纤维细胞培养
  • 2.2 获得稳定转染的人增生性瘢痕成纤维细胞
  • 2.3 RT-PCR检测转染后细胞中TGF-β RⅡmRNA水平的变化
  • 2.4 TGF-βRⅡ shRNA对成纤维细胞TGF-βRⅡ蛋白表达的影响
  • 2.5 TGF-βRⅡ shRNA对成纤维细胞增殖的影响
  • 2.6 TGF-βRⅡ shRNA对成纤维细胞凋亡的影响
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间的主要成果

    • 相关论文文献

    本文来源: https://www.lw50.cn/article/0e589a42602799b42d4a7195.html