弓形虫自然弱毒株（QHO）棒状蛋白2基因片段的克隆、表达及鉴定

论文摘要

弓形虫（Toxoplasma,gondii）为专性细胞内寄生原虫,全球分布,能引起人兽共患的弓形虫病,全世界的感染率为34%,大多数为隐形感染,但对于孕妇免疫功能抑制或低下者,能造成严重危害,孕妇感染常引起流产、畸胎、死胎,对于肿瘤患者或AIDS病人等免疫功能受损者,弓形虫是引起死亡的主要病体之一;弓形虫对畜牧业生产也造成了严重危害。因此,弓形虫病诊断和疫苗的研究成为弓形虫病防治工作的重点。ROP2蛋白为弓形虫生活史各期均分泌的抗原,具有高度的保守性和免疫原性,作为疫苗候选因子受到人们的关注。本试验以弓形虫青海自然弱毒株（QHO）速殖子为材料,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增到编码棒状蛋白2（ROP2）的基因片断,插入到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109。结果表明获得片段为1919bp,含有一个完整的1686bp的开放阅读框架（ORF）,与ROP2基因己知序列（Z36906）的ORF具有97.4.%的同源性,氨基酸序列具有93.9%的同源性。弓形虫ROP2蛋白序列与其它棒状体蛋白如ROP8,ROP4,ROP7,ROP18, ROP5,ROPl7也具有一定的相似性,说明弓形虫棒状体蛋白可能由起源相同的几个蛋白家族掏成。再通过设计两对引物,应用PCR方法从阳性克隆重组质粒分别扩增到约1603bp（Q1）和1132bp（Q2）的ROP2的基因片段,经限制性内切酶酶切,胶回收纯化,插入载体pET-28b多克隆位点,构建原核质粒重组体pET-Ql和pET-Q2,并转化E.coli BL21（DE3）,筛选阳性克隆,限制性酶切分析及测序鉴定后,以异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,用SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况,应用Western-blot分析了重组抗原的活性,并纯化表达产物,为研制弓形虫病疫苗奠定基础。

论文目录

摘要

Summary

前言

第一部分文献综述

弓形虫病核酸疫苗研究进展

1 保护性抗原基因

1.1 SAG

1.2 GRA

1.3 ROP

2 核酸疫苗研究

2.1 单基因疫苗

2.2 复合基因疫苗

2.3 混合基因疫苗

3 结语

参考文献

第二部分研究报告

第一章弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2（ROP2）

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章弓形虫QHO 株ROP2 基因在大肠杆菌