人甲状腺球蛋白（Thyroglobulin, Tg）为甲状腺细胞合成的一种特有的糖蛋白,被认为是自身免疫性甲状腺疾病（Autoimmune thyroid disease, AITD）主要的自身抗原之一,其抗体的检测尤其对桥本氏甲状腺炎的诊断有重要意义。至今为止,国内外所用测定TgAb方法中,Tg标准多从人甲状腺组织提取获得,组织来源受限,此外使用重组Tg建立的检测方法尚未见相关报道。 目的:利用重组技术克隆Tg抗原决定簇基因（1491bp）,分别重组到原核表达型质粒pET102/D-TOPO和真核表达型质粒pcDNATM3.1D/V5-His-TOPO（?）中,分别获得原核与真核表达系统Tg抗原决定簇基因融合蛋白（简称为Tg原核蛋白和真核蛋白）,以重组Tg融合蛋白做抗原建立ELISA检测法并初步应用于临床。 方法:采用TRIzol一步法,从手术切除的Graves’病患者甲状腺组织中提取总RNA,运用RT-PCR方法和DNA重组技术克隆了Tg抗原决定簇基因,通过PCR、酶切和基因序列分析予以确定;将该基因分别重组到原核表达型质粒pET102/D-TOPO和真核表达型质粒pcDNATM3.1D/V5-His-TOPO（?）中,在保证Tg抗原决定簇基因读码框架正确的基础上,将重组原核表达型质粒转化入E.coli BL21 StarTM（DE3）,异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β—D—thioglactoside, IPTG）进行诱导表达,优化表达条件;将重组真核表达型质粒转染到真核细胞CHO中,用不同浓度的G418筛选出稳定的细胞株并表达出蛋白。表达产物经Ni·NTA His·Bind树脂亲和层析纯化,获得具有一定纯度的重组Tg原核蛋白与真核蛋白。通过SDS—PAGE、ELISA检测重组蛋白的分子量和免疫活性,考马斯亮蓝染色法定量。分别用重组Tg原核蛋白与真核蛋白作为抗原,建立ELISA法,初步用于临床。 结果:成功提取总RNA,RT—PCR逆转录出cDNA,PCR扩增出目的基因并用多种方法鉴定无误;Tg抗原决定簇基因（1491bp）
本文来源: https://www.lw50.cn/article/10aae29644fbc6b71803d58d.html