目的:toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）在机体天然免疫系统识别病原体过程中发挥着非常重要的作用。近年来炎症在糖尿病中的作用受到重视,而AKT信号通路之一就是胰岛素信号通路。本实验旨在研究,在脂肪细胞中激活TLR4后,对于脂肪细胞中AKT信号通路有无影响:并且探讨天津地区人群中TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile多态性以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）基因Prol2Ala多态性与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）的关系。方法:1.用DMEM培养基培养3T3-L1细胞,待其接触抑制以后,加入诱导剂使其分化为脂肪细胞。2.利用油红染色的方法对脂肪细胞进行鉴定。3.在脂肪细胞中加入脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）,作用1 h后,提取细胞总RNA,采用realtime-PCR的方法测定TLR4的mRNA表达丰度。4.提取细胞总蛋白,western blot的方法检测p-AKT蛋白表达水平。5.分别提取365名2型糖尿病人和95名健康人的基因组DNA,PCR扩增目的基因片断。6.用变性高效液相色谱（denaturing high performance liquidchromatography,DHPLC）筛查TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点以及PPARγ基因Prol2Ala位点多态性。结果:1.诱导3T3-L1细胞,诱导分化率比较高。诱导7-8天,90%以上的细胞分化成为脂肪细胞。2.油红染色结果呈阳性,大部分脂肪细胞染成红色,胞浆中见大量脂滴。3.脂肪细胞在用LPS作用1 h后,TLR4的mRNA的表达明显增加（P＜0.05）。4.在脂肪细胞中加入LPS后,p-AKT蛋白表达水平下降（P＜0.05）。5.在T2DM组和对照组均未筛查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突变基因型的存在。6.T2DM组和健康人对照组PPARγ基因Prol2Ala位点P/A的基因型频率分别为0.074和0.032（27/365和3/95）,两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.诱导3T3-L1细胞分化成脂肪细胞,具有较高的分化率,可达90%以上。2.脂肪细胞中加入LPS后,TLR4的mRNA的表达丰度增加,而p-AKT水平下降,初步说明TLR4的表达可以抑制脂肪细胞中AKT信号通路。3.天津地区人群未筛查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突变基因型,其多态性与T2DM无明显关联。4.天津地区人群PPARγ基因Prol2Ala多态性与T2DM无明显关联。5.DHPLC是一种快速有效的基因突变筛查方法,可以用来筛查2型糖尿病易感基因,预测糖尿病发病的易感性。
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