生长抑素（SS,somatostatin）是一种抑制脑垂体分泌生长激素的神经调节肽。动物生长受生长激素（GH）的控制,而生长激素受生长激素释放因子（GRF）和生长激素释放抑制激素（SS）的调节,其中SS为负性调控因子。抑制SS基因的表达,降低SS在动物体内的分泌,可相应提高GH的浓度,最终表现为使机体代谢降低,从而起到促进动物生长的目的。本实验设计合成并构建生长抑素基因靶向siRNA的稳定表达载体,并在细胞水平上观察其对SS表达的影响。分别在SS基因mRNA的433 bp、539 bp、418 bp处找到潜在靶位点合成siRNA转录模板的发夹结构,插入pSilencerTM 2.1-U6载体构建重组质粒。模拟siRNA识别的mRNA靶序列的局部二级结构,分析其与siRNA干涉效率之间的关系。提取小鼠脑组织总RNA扩增得到SS基因构建其真核表达载体,共转染细胞瞬时表达,检测SS基因表达变化。经测序鉴定证明siRNA转录模板完整、正确的插入到pSilencerTM 2.1-U6质粒中,重组质粒pcDNA3.1-SS与pEGFP-SS序列完全正确。通过对转染细胞的RT-PCR,Real Time PCR,荧光法,Western blot,RIA等检测,观察siRNA对抑制SS基因表达的作用,筛选抑制效果较好的siRNA。转染细胞在mRNA水平及蛋白水平均检测到不同程度的抑制,并与其识别的靶序列二级结构有着密切的关系。本研究成功构建了生长抑素基因靶向siRNA稳定表达载体,能在哺乳动物细胞中表达,对靶基因有抑制作用。
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