DCD是最近从人汗腺中发现的抗菌肽,DCD-1L是它的衍生物,能够有效地抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌,具有广谱的抗菌活性。与抗生素不同,抗菌肽不会在生物体内富集,也不易诱导产生耐药菌株,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。因此我们利用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,选用真核表达系统来表达、筛选具有更高抗菌活性的抗菌肽,有重要的经济价值和理论意义。目前,巴斯德毕赤酵母已经成为分子生物学研究中,表达外源蛋白的一种重要工具。它不仅具有原核生物生长快、表达量高、操作简便的特点,又具备高等真核细胞的翻译后加工和修饰功能,所以此系统得到了广泛地应用。我们利用含随机突变序列的两条引物以重叠延伸PCR制备出突变基因,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMDII68中,形成突变库,利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE在培养基上清中鉴定出了表达蛋白。随后,我们用抑菌圈实验对突变蛋白的抗菌功能进行了初步筛选,由于利用LiCl的化学方法进行转化,库容量仅达到104,这对功能抗菌肽的筛选有一定的限制作用,这要求我们在以后的工作中设法做进一步的改进。总之,本研究利用定向进化的方法,在毕赤酵母载体pGAPZαC中构建出DCD-1L的突变库,实现了目的基因在真核系统中的表达,并对功能抗菌肽做了初步筛选。
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