伪狂犬病病毒gE基因在大肠杆菌中的表达

论文摘要

伪狂犬病病毒是疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的成员，可以引起猪、牛、羊及野生动物的伪狂犬病（又称Aujeszky氏病），猪是该病毒的天然宿主、也是主要感染源。伪狂犬病给养猪业造成了巨大经济损失，其危害仅次于猪瘟和口蹄疫。作为主要的诊断抗原，伪狂犬病病毒糖蛋白E（glycoprotein,gE）在伪狂犬根除计划中发挥重要的作用。为获得大量的、成本较低的诊断抗原，本研究利用大肠杆菌表达系统对伪狂犬病病毒gE主要抗原区域进行了表达，为gE-ELISA试剂盒的研制提供一定的理论依据和借鉴。本研究主要内容：根据GenBank中伪狂犬病毒gE基因序列，设计了一对引物，PCR扩增长度为558bp的gE基因去信号肽后的主要抗原区域（157-714bp），将其克隆进测序载体PGEM-Teasy中，成功构建质粒PGEMTeasy-gE。用BamhI和HindⅢ将gE基因主要抗原区域从PGEM-Teasy中切出，然后与同样酶处理的原核表达载体pet32a连接，命名为pet-gE。在IPTG的诱导后，经SDS-PAGE电泳发现43ku处出现特异性蛋白条带。研究了目的蛋白表达量与各个培养条件的关系，优化后的最佳表达条件为IPTG浓度为1mM，诱导时间为5小时时的蛋白表达量最大。经过western-blot分析，表达产物具有很好的抗原性。该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白，为血清学鉴别诊断方法gE-ELISA的建立打下很好的基础，同时gE-ELISA也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。

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1 引言

1.1 伪狂犬病病毒研究进展

1.1.1 病原学

1.1.2 病毒囊膜与糖蛋白

1.1.3 病毒感染和复制

1.1.4 潜伏性

1.2 伪狂犬病病毒的诊断学研究进展

1.2.1 病毒分离（Ⅵ）

1.2.2 动物接种试验

1.2.3 电镜技术

1.2.4 血清学检测方法

1.2.5 分子生物学检测技术

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种和载体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要溶液配方

2.2 方法

2.2.1 引物的设计与合成

2.2.2 PRV Min-A株DNA的提取

2.2.3 PCR扩增

2.2.4 PCR扩增产物的凝胶电泳

2.2.5 PCR扩增产物的回收

2.2.6 目的片段与载体的连接

2.2.7 感受态细胞的制备

2.2.8 连接产物的转化

2.2.9 碱裂解法小量提取质粒

2.2.10 重组质粒的鉴定

2.2.11 原核表达载体的构建

2.2.12 重组质粒的诱导表达

2.2.13 最佳诱导条件的确定

2.2.14 表达产物的检测

3 结果

3.1 PCR扩增结果

3.2 重组质粒PET-gE的鉴定结果

3.2.1 重组质粒的酶切鉴定

3.2.2 重组质粒的PCR鉴定

3.2.3 重组质粒的序列测定

3.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测

3.3.1 不同IPTG浓度的诱导表达

3.3.2 不同时间的诱导表达

3.4 Western-blot分析

4 讨论

4.1 本研究的必要性

4.2 实验中遇到的困难与问题

4.3 gE-ELISA的优点

4.4 伪狂犬病的根除

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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