马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）为兰氏分群中的C群链球菌,能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡。马链球菌兽疫亚种危害集约化养猪业的发展,同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。马链球菌兽疫亚种的全基因组测序工作尚未完成,新的毒力基因有待进一步发现。本实验以SEZ强毒株ATCC35246和弱毒疫苗株ST171为研究对象,利用SSH技术分析了其基因组之间的差异,发现了15个可能的毒力基因片段,并对其中6个毒力基因片段在其他链球菌上的分布进行了研究。为了获得马链球菌兽疫亚种毒力菌株特有的基因片段,将强毒菌株ATCC35246与弱毒疫苗株ST171进行抑制性差减杂交。提取两株细菌基因组DNA,RsaⅠ酶切回收。回收的ATCC35246基因组分别连接两个不同的接头,经过两轮杂交、两轮PCR扩增后,得到ATCC35246特有的基因序列。扩增PCR产物并连接至PMD-18T载体,转化大肠杆菌TOP10铺氨苄平板,获得约800个克隆。随机挑取296个克隆,进行菌落PCR鉴定,扩增出一系列100-2000 bp大小的片段。将得到的296个阳性克隆的PCR产物变性固定于尼龙膜,分别与地高辛标记过的ATCC35246和ST171酶切基因组DNA进行杂交。斑点杂交结果得到20个有差异的PCR样品,并将其进行测序,测序结果递交GenBank进行同源性查找,发现了15个可能的新的毒力基因片段。这些基因编码的蛋白和酶可能与细胞表面结构、分子合成、能量代谢、调控蛋白、转运蛋白以及其他一些未知的功能有关,这在国内外尚属首次报道。选择其中6个具有代表性的片段序列设计引物,运用PCR检测这些片段在其他16株链球菌上的分布。结果表明,这6个片段在ATCC35246上均能检出,而在ST171上仅检出一例,证明了PCR结果具有较高的可靠性。在其他马链球菌兽疫亚种菌株中,这6个片段都有很广泛的分布,在其他血清型的链球菌中也有一定的分布,而在猪链球菌2型中则未见以上基因。本研究在马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株中发现了15个可能的毒力基因,为用PCR方法检测马链球菌兽疫亚种不同毒力菌株和进一步研究该菌的致病机理奠定了良好的基础。
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