牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因的克隆与原核表达

论文摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti）寄生于牛红细胞和淋巴细胞引起的一种血液原虫病。近些年,瑟氏泰勒虫病的发生呈上升趋势,给相关国家的畜牧业带来了较大的经济损失,引起了国内外兽医界的广泛关注。据报道T.sergenti梨浆虫表面蛋白p23表达于瑟氏泰勒虫裂殖子膜表面,是主要免疫原性蛋白之一。本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫日本株p23表面蛋白基因（D84447）设计了一对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取了牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,克隆了大小为507 bp的p23表面蛋白基因的部分片段,对所克隆的p23基因序列与基因库中D84447序列进行比较分析,结果同源性达99.4%,证明该基因片段确为牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因。p23表面蛋白基因与pGEX-4T-1载体进行连接、酶切鉴定、PCR鉴定和测序,成功地构建了含有目的基因片段的原核表达载体pGEX-4T-p23。然后将原核表达载体pGEX-4T-p23转化到E.coli BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达出约46 ku的p23融合蛋白。同时根据SDS-PAGE对融合蛋白的表达条件进行了优化,确定最佳诱导时机是转接种后2.0 h,最佳诱导温度是34℃,最佳诱导时间为6.0 h,最适IPTG浓度为0.08 mmol/L。在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5.0软件分析占菌体总蛋白的31.7%,Western blotting检测,该融合蛋白可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性。

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摘要

ABSTRACT

前言

1 牛瑟氏泰勒虫病原学研究

2 牛瑟氏泰勒虫病流行病学及危害

3 牛瑟氏泰勒虫病的防治研究

3.1 蜱的防治

3.2 虫体的防治

4 牛瑟氏泰勒虫病诊断方法研究

4.1 组织学诊断方法

4.2 免疫学诊断方法

4.3 分子生物学诊断方法

5 牛瑟氏泰勒虫表面蛋白及疫苗研究

6 本课题的研究目的和意义

试验研究

1 材料

1.1 血液来源

1.2 克隆用菌种和载体

1.3 试剂

1.4 主要仪器

1.5 主要试剂的配制

1.6 主要培养基的配制

2 方法

2.1 引物设计与合成

2.2 牛瑟氏泰勒虫基因组DNA的提取

2.3 目的基因的PCR扩增

2.4 p23基因的克隆与鉴定

2.5 原核表达载体的构建

2.6 pGEX-4T-p23在大肠杆菌中的表达

2.7 重组蛋白pGEX-4T-p23表达条件的优化

2.8 融合蛋白的大量表达及可溶性分析

2.9 免疫印迹（Western blotting）分析

3 结果

3.1 目的基因的PCR结果

3.2 pMD18-T-p23的鉴定

3.3 pGEX-4T-p23的鉴定

3.4 pGEX-4T-p23原核表达与鉴定

3.5 重组蛋白表达条件的优化

3.6 融合蛋白的大量表达和可溶性分析

3.7 Western-blotting鉴定

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

作者简介

牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因的克隆与原核表达

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