噬菌体展示技术筛选与褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡结合短肽

论文摘要

解剖1000头褐飞虱5龄若虫,获取中肠部位,研磨后梯度离心得到刷状缘膜囊泡BBMV,运用噬菌体展示技术筛选与BBMV特异结合的短肽,通过PCR扩增连接短肽序列和绿色荧光蛋白GFP序列,将重组序列先后连接到克隆载体pMD18-T和表达载体pET-32a,并分别转化大肠杆菌JM109和BL21,最后用IPTG诱导表达重组序列,得到大小约45KDa的融合蛋白,利用表达载体pET-32a的组氨酸标签提纯融合蛋白。通过膜饲喂方法以融合蛋白喂食褐飞虱5龄若虫,解剖得到中肠,将中肠在PBS溶液中清洗后转移至荧光显微镜下用蓝紫光观察,结果显示融合蛋白可以结合到褐飞虱的中肠。

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Abstract

1 前言

1.1 苏云金芽胞杆菌

1.1.1 苏云金芽胞杆菌概述

1.1.2 Cry 蛋白的杀虫机制

1.2 噬菌体展示技术

1.2.1 噬菌体展示技术概述

1.2.2 噬菌体展示技术的应用

1.3 绿色荧光蛋白

1.3.1 绿色荧光蛋白概述

1.3.2 绿色荧光蛋白的应用

1.4 稻飞虱的危害与主要防治措施

1.5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 菌株与载体

2.1.3 培养基

2.1.4 试剂盒与反应体系

2.1.5 其他试剂和材料

2.2 方法

2.2.1 提取刷状缘膜囊泡BBMV

2.2.1.1 梯度离心中肠匀浆液

2.2.1.2 碱性磷酸酶活性测定

2.2.1.3 蛋白浓度测定

2.2.2 噬菌体肽库淘选实验

2.2.2.1 噬菌体滴度测定

2.2.2.2 淘选程序

2.2.2.3 提取单克隆噬菌体DNA

2.2.2.4 噬菌体DNA 测序

2.2.3 构建克隆载体

2.2.3.1 设计引物

2.2.3.2 PCR 反应

2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳

2.2.3.4 PCR 产物回收

2.2.3.5 连接克隆载体

2.2.3.6 转化JM109

2.2.3.7 提取重组质粒

2.2.3.8 单双酶切验证

2.2.3.9 测序验证

2.2.4 构建表达载体

2.2.4.1 双酶切重组质粒

2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳

2.2.4.3 切胶回收

2.2.4.4 连接表达载体

2.2.4.5 转化BL21

2.2.4.6 提取重组质粒

2.2.4.7 单双酶切验证

2.2.5 诱导表达

2.2.6 蛋白提纯

2.2.7 SDS-PAGE 验证

2.2.8 膜饲法观察结合情况

3 结果和分析

3.1 BBMV 提取结果

3.2 噬菌体肽库淘选结果

3.3 克隆结果

3.3.1 PCR 反应结果

3.3.2 单双酶切验证结果

3.4 融合蛋白诱导和提纯结果

3.5 融合蛋白与中肠结合情况

4 讨论

参考文献

致谢

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