肠道病毒71型VP1基因抗原的表达及其腺病毒载体穿梭质粒的构建与鉴定

论文摘要

肠道病毒71型（enterovirus71,EV71）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。其感染可以导致手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）、无菌性脑膜炎（asepic meningitis）、脑炎（encephalitis）和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病（poliomyelitis-like paralysis）等多种与神经系统相关的疾病。EV71病毒的流行范围遍及全球且目前尚无有效地预防措施。因此,EV71病毒快速诊断试剂和基因工程疫苗的研制有着广阔的前景。本论文包括两部分:一.肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因抗原的克隆、表达与鉴定在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06 VP1基因并测序的基础上,将VP1基因部分编码序列克隆到表达载体pET28a（+）上,构建了重组表达质粒pET28a（+）/（502～891） VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的重组蛋白相对分子质量为19kDa,与预计大小一致。Western Blotting证实,重组蛋白与His-Tag抗体有特异性反应,重组蛋白作为抗原免疫小鼠获得的血清与细胞培养的EV71VP1蛋白也有特异性反应。本研究表明我们成功表达纯化了具有免疫原性的EV71VP1重组蛋白,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。二.肠道病毒71型VP1基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定与表达在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06VP1基因并测序的基础上,以含有VP1基因序列的质粒pMD20-T/VP1为模板,用分别含有AgeI及EcoRI酶切位点的肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因上、下游引物,通过PCR扩增获得EV71VP1基因片段,基因片段回收后,分别以AgeI及EcoRI双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒CMV启动子下游AgeI和EcoRI位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒E3-pSKE3L-CMV-VP1-SV40-E3R,通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定,将穿梭质粒转染Hep-2,以抗EV71VP1多克隆抗体为一抗,利用Western blotting检测了其在Hep-2细胞中的瞬时表达。穿梭质粒可进一步与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组,以产生重组腺病毒载体。本实验为构建开发安全、高效、产业化的人3型腺病毒、EV71病毒重组双价疫苗奠定了基础。

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摘要

Abstract

引言

第一章文献综述

1 肠道病毒71 型研究进展

2 腺病毒及其载体研究进展

第二章肠道病毒 71 型衣壳蛋白 VP1 基因抗原的克隆、表达与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章肠道病毒71 型衣壳蛋白 VP1 基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达