目的:利用NGF诱导的PC12细胞分化模型,探讨ERK通路、P53/P21蛋白和CDK5/P35蛋白在神经元分化过程中的可能作用及相互关系。 方法:用包含p53突变基因的逆转录病毒质粒pBabe-P53/m175转染PC12细胞,经筛选建立野生型p53失活的细胞株PC12（P53/m175）,经NGF处理后,Western blotting检测P53和P21的表达水平,流式细胞仪测定细胞周期的改变,细胞生长曲线判断细胞的增殖状况,与正常PC12细胞相比较;使用CDK5特异性抑制剂roscovitine处理PC12细胞,Western blotting分析处理组和对照组CDK5、P35的表达,倒置相差显微镜观察神经突起生长;结合使用ERK通路特异性抑制剂U0126及pCMV-CDK5、pCMV-P35共转染PC12细胞,Western blotting检测磷酸化ERK、P53、P21、P35和CDK5蛋白的表达,相差显微镜观察神经突起的生长状况,比较不同处理组之间的差异。 结果:P53/P21蛋白在NGF作用后12h左右开始增加,40h达到高峰并一直持续4天以上,细胞周期的G1期阻滞出现的时间与蛋白表达开始增加的时间相一致,野生型P53失活的PC12（P53/m175）细胞在NGF作用后则不能表达P21蛋白,细胞周期G1期阻滞的程度也显著下降,但细胞仍然能够伸出神经突起;NGF刺激PC12细胞后,P35蛋白表达增加,CDK5蛋白含量未见明显改变,使用CDK5抑制剂roscovitine预处理后,PC12细胞的神经突起生长受到很大抑制,细胞不出现明显的分化表型;Western blotting检测证实PC12（P53/m175）细胞和CDK5抑制剂预处理的PC12细胞在NGF作用后,ERK蛋白能够被磷酸化激活,而U0126预处理的PC12细胞在NGF刺激后,ERK通路的活化被阻断,P53、P21和P35蛋白的表达不出现显著增加,细胞的分化被明显的抑制,如果使该处理组细胞,共转染质粒pCMV-CDK5、pCMV-P35,则细胞能够开始生长神经突起,但不能完全恢复到正常PC12细胞的分化水平。 结论:ERK通路的早期活化是实现NGF诱导的PC12细胞分化的必需条件,P53/P21蛋白的表达增加,主要介导了细胞周期G1期阻滞的发生,与神经突起生
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