食管癌是常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。Fascin是一种肌动蛋白结合蛋白，现有的研究提示它在多种上皮性肿瘤中表达上调并与肿瘤的增殖、移动侵袭相关。本课题组在以往的研究中发现，在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化中，fascin基因呈现上调表达。最近也有报道fascin蛋白在食管癌组织中的表达明显增强。然而，fascin蛋白在食管癌中的功能以及它在食管癌中上调表达的作用机制至今尚不清楚。为此我们设计并合成了靶向Fascin基因的siRNA，试图通过RNA干扰的方法减少肿瘤细胞Fascin基因的表达，来探讨fascin对肿瘤细胞分裂增殖、分化和浸润等生物学行为的影响。这将有助于揭示fascin基因在肿瘤生物学方面的功能，也有助于从分子水平阐明Fascin在这些上皮来源的肿瘤组织细胞中上调表达的机制。 内容与方法 1．以HeLa细胞为阳性对照，用免疫荧光和蛋白质印迹等方法检测fascin蛋白在食管癌细胞系EC109中的表达情况。 2．设计、合成靶向fascin基因的siRNAs，并重组到哺乳动物细胞的siRNA表达载体pSUPER．neo中，获得重组的表达载体。 3．将获得的重组质粒转染到EC109食管癌细胞中，用G418筛选的办法建立稳定表达fascin基因siRNAs的细胞系。 4．用蛋白印迹和半定量PCR的方法，分别在蛋白和RNA水平检测siRNA对EC109细胞中fascin的干扰效果，选择干扰效果好的细胞克隆进行下一步实验。 5．用扫描电镜、蛋白印迹、免疫荧光、酶谱以及裸鼠成瘤实验等方法，探讨fascin表达抑制后对细胞形态、增殖、移动、侵袭和粘附等生物学行为的影响。 6．采用基因芯片的方法筛选出fascin表达减弱后的相关差异表达基因。 结果和结论 1．免疫荧光和蛋白质印迹检测均发现，fascin在食管癌细胞系EC109中的表达水平和HeLa中的表达水平几乎一致。而HeLa是公认的fascin高表达细胞模
本文来源: https://www.lw50.cn/article/3e392cde816fd35ac33976d7.html