目的研究乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其产物HBx与HBx结合蛋白细胞色素C氧化酶Ⅲ（COXⅢ）的相互作用及其对线粒体结构和功能的影响。方法将HBV X基因真核表达载体pcDNA3-X及空载体pcDNA3转染成人肝细胞HL-7702细胞,经过2周G418筛选,获得稳定表达的新细胞株,分别命名为HL-7702/HBx和H-7702/pcDNA3,RT-PCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL-7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RT-PCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COXⅢ表达水平变化。通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性,罗丹明123荧光染色法检测线粒体跨膜电位及流式细胞术检测细胞内ROS水平, Western blot方法比较各组细胞NF-?B和c-myc表达水平的差别。结果重组质粒pcDNA3-X转染后经G418筛选,RT-PCR和Western-blot分析结果显示HL-7702/HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RT-PCR和Western-blot结果发现HBV X基因下调COXⅢ蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低,同时线粒体跨膜电位也发现下降,而细胞内ROS水平没有发生明显改变。Western blot结果表明与氧化应激相关的蛋白c-myc表达下调,而NF-?B表达不发生变化。结论HBV X基因通过转录后水平调节COXⅢ表达, HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性,降低线粒体跨膜电位诱发氧化应激,但不改变细胞内ROS水平。
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