胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）是具有自我更新和高度分化潜能的细胞,能在体外保持未分化状态无限增殖传代。目前已建立了多种动物和人的ESCs系。昆明系小鼠是我国生物实验中应用最多的实验动物。故本试验以昆明小鼠为实验材料,探讨了小鼠ESCs（mouse ESCs,mESCs）建系的技术方法,为实验室下一步研究水牛ESCs建系提供一套可行的技术理论体系。本试验包括两部分内容,第一部分为类mESCs分离方法的研究。主要探讨不同胚胎期（扩展囊胚和孵化囊胚）和传代方法对分离类mESCs效率的影响。第二部分为类mESCs鉴定的研究。包括碱性磷酸酶（AKP）染色、RT-PCR分析Oct4和Sox2表达、核型分析和分化能力鉴定。其中检测类mESCs分化能力又通过自发分化和bFGF诱导分化两方面进行。结果显示:1)扩展囊胚分离类mESCs效率高于孵化囊胚（P＜0.05）。虽然在贴壁率和原代克隆形成率二者没有显著差异（P＞0.05）,但在孵化囊胚组未获得类mESCs;2)从类mESCs生长形态和AKP染色上看,5代后类mESCs传代使用机械法或Trypsin/EDTA消化法,对维持类mESCs未分化状态没有差异,说明无论机械法还是Trypsin/EDTA消化法都适合对类mESCs进行传代;3)本实验获得的类mESCs传至25代未见形态上的分化,AKP染色呈强阳性,RT-PCR分析显示表达Oct4和Sox2,核型分析显示为正常核型40XY,正常核型率为70%,说明本试验分离的类mESCs具有ESCs的基本特征;4)类mESCs在去除饲养层和LIF、bFGF之后,经悬浮培养形成类胚体（EB）,EB贴壁后在无LIF、bFGF下自发分化为多种类型细胞;在无LIF、血清以及含20 ng/mL bFGF下诱导分化成神经细胞;AKP染色显示,这两种方式分化的细胞均呈阴性;用Nestin检测诱导分化,呈阳性。说明类mESCs具有体外分化潜能。综上所述,本试验成功分离出类mESCs,而且所分离的类mESCs符合ESCs的一般特征。这为本实验室下一步研究水牛ESCs建系打下了基础。
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