纤维素高效降解菌的筛选及离子束诱变研究

论文摘要

纤维素是地球上最丰富的有机物质,世界上每年生成的有机物质约有一半为纤维素类物质,但其水解、利用均很困难,绝大部分都被弃置,如何更有效的利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。自然界中的纤维素类物质大部分是由微生物降解,因此对纤维素降解菌的筛选及人工改造是未来纤维素利用的重要途径。本研究通过不同来源的材料筛选纤维素降解菌,利用低能Ar+离子对筛选菌株进行诱变,选育纤维素高效降解突变株,并对突变株CBH基因的分子变化进行了研究。获得如下主要结果:1从腐叶下的泥土、造纸厂排放的污水及腐木共筛选得到6株降解纤维素菌株,通过相对酶活的比较,最终得到一株纤维素高效降解菌,命名为280TS。形态学观察和ITS序列分子鉴定,将280TS菌归属于青霉属（Penicillium）。2对280TS进行发酵产酶条件的优化,发现其最适产酶温度为30℃,最适产酶pH为6.0,发酵培养120小时达到产酶高峰。3利用低能Ar+离子注入孢子,研究了存活率和纤维素降解能力突变率,结果显示在Ar+注入能量为15keV时,适宜的注入剂量为2.08×1015Ar+/cm2。4经过两轮诱变和筛选,得到了1株高效降解纤维素的突变菌株,经传代实验表明该菌株在高效降解纤维素的遗传性状上表现稳定,酶活测定突变株CMC酶活提高了3.4倍,FPA酶活提高了4.3倍。5通过RT-PCR克隆了出发菌和突变菌cbhⅡ基因,经Blast分析表明出发菌与绿色木霉cbhⅡ基因的同源性达到80%以上。通过突变株cbhⅡ基因与出发菌cbhⅡ基因比较,发现突变菌cbhⅡ基因发生了六处突变,并且导致了氨基酸序列发生了四处改变,这一结果为进一步研究纤维素降解菌酶活的改变提供了分子依据。

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Abstract

1 文献综述

1.1 纤维素酶的研究

1.2 离子束生物工程学研究进展

2 引言

2.1 研究目的与意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

3 材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 材料来源

3.1.2 培养基

3.2 仪器设备和试剂

3.2.1 主要仪器设备

3.2.2 主要试剂

3.3 研究方法

3.3.1 纤维素分解菌株的分离、筛选

3.3.2 纤维素降解菌280TS的形态观察与显微镜检

3.3.3 280TS纤维素降解菌的分子鉴定

3.3.4 纤维素降解菌280TS发酵产酶条件等单因子优化

3.3.5 280TS的低能离子诱变

3.3.6 280TS出发菌与突变菌CMC、FPA酶活的测定及比较

3.3.7 280TS cbh基因的克隆

4 结果与分析

4.1 纤维素降解菌的筛选

4.2 纤维素降解菌280TS的形态学鉴定及分子鉴定

4.3 纤维素降解菌280TS的发酵产酶等单因子优化

+）'>4.4 280TS纤维素降解菌的低能离子诱变（Ar⁺）

4.5 突变株的筛选

4.6 突变株遗传稳定性考察

4.7 突变菌与出发菌CX酶活及FPA酶活的比较

4.8 突变体的分子分析

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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