目的研究缺氧条件下,大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells ,PASMCs）内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的变化,及其对大鼠PASMCs增殖和凋亡的调控作用,并初步探讨细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）1/2信号通路在该调控过程中的作用。材料与方法采用组织块贴壁法原代培养正常大鼠PASMCs,选用第2-4代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS清除剂Tiron、ERK1/2抑制剂PD98059进行分组干预。通过NBT还原法、DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平,免疫荧光法检测磷酸化-ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达,MTT比色法、增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测Bcl-2和Bax蛋白表达。结果1.缺氧组细胞内ROS水平（NBT:0.214±0.024,DCFH-DA:39.33±3.27）明显高于对照组（NBT:0.114±0.017,DCFH-DA:15.84±2.86）（n=6,P均<0.01）。2.缺氧组的增殖活性（MTT:0.325±0.035,PCNA:53.83±4.48）与对照组（MTT: 0.228±0.019,PCNA:42.58±3.71）相比显著增高（n=6,P均<0.01）,而缺氧组凋亡率（2.42±0.74）显著低于对照组（4.50±0.45）（n=6,P <0.01）;缺氧+Tiron组增殖活性（MTT: 0.281±0.029,PCNA:47.82±3.41）与缺氧组比较明显增殖活性降低（n=6,P均<0.05）,而凋亡率（5.75±0.94）却明显升高（n=6,P<0.01）。3.缺氧组P-ERK1/2蛋白表达（63.50±6.16）显著高于对照组（26.17±3.76）（n=6,P<0.01）,使用Tiron后缺氧诱导的P-ERK1/2表达被显著抑制（31.00±4.15）（n=6,P<0.01）。4.缺氧+PD98059组与缺氧组相比增殖活性（MTT:0.292±0.028,PCNA:49.75±2.66）明显降低（n=6,P均<0.05）,而凋亡率（4.83±0.82）明显升高（n=6,P<0.01）;缺氧+Tiron+PD98059组与缺氧+Tiron组相比,对细胞增殖（MTT:0.284±0.032,PCNA:48.41±3.25）和凋亡（5.33±0.75）的影响均无明显差异（n=6,P均>0.05）。5.与对照组（Bcl-2:0.098±0.017,Bax:0.210±0.031,Bcl-2/Bax:0.465±0.021）相比较,缺氧组Bcl-2蛋白表达（0.141±0.024）增强（n=6,P<0.05）,Bax蛋白表达（0.074±0.020）减弱（n=6,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值（1.972±0.283）升高（n=6,P<0.01）。6.缺氧+Tiron组与缺氧组比较,Bcl-2蛋白表达（0.124±0.018）降低（n=6,P<0.05）,同时Bax蛋白表达（0.182±0.019）增强（n=6,P<0.05）,Bcl-2 /Bax比值降低（0.678±0.071）（n=6,P<0.01）。结论缺氧条件下,PASMCs内ROS水平显著升高,可能通过活化下游ERK1/2信号通路,促进PASMCs的异常增殖并抑制细胞凋亡,引起缺氧PASMCs增殖和凋亡的关系失衡,从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。此外,初步探讨了缺氧条件下ROS可能是通过促进Bcl-2/Bax蛋白表达比值升高来抑制PASMCs凋亡。
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