目的：1.用基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌Rv0685抗原,用Western blotting分析其特异性,制备蛋白芯片,进一步验证其特异性。2.用实验室自制纯化的ESAT6、CFP10、M16和M38抗原及购买的LAM抗原制备蛋白芯片,检测130例临床结核病患者和30例健康人血清,分析其敏感性和特异性,为自主研发结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片试剂盒确立抗原基础。方法：1.依据GeneBank中公布的结核分枝杆菌标准株（H37Rv）Rv0685基因序列设计并合成引物；以处理过的结核分枝杆菌标准株（H37Rv）为模板,通过PCR扩增得到Rv0685抗原基因片段；将酶切后的基因片段与原核表达载体pQE80L连接,转化至E.coli DH5a感受态,挑选阳性克隆进行序列测定,将序列正确的连接产物转化入大肠杆菌M15,用最适的温度、IPTG浓度进行诱导,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,HisTrap FF组氨酸标签蛋白纯化基质进行蛋白纯化,Western blotting分析其特异性。将Rv0685抗原稀释五个浓度梯度点于醛基化修饰的玻片上,制备成结核抗体检测蛋白芯片,用临床样本对其特异性进行进一步验证。2.将制备的结核分枝杆菌抗原ESAT6、CFP10、M16和M38及购买的LAM抗原点于醛基化修饰的玻片上,制备成结核抗体检测蛋白芯片；使用该芯片对130例临床结核病患者和50例健康体检者血液样品进行检测,分析其敏感性和特异性,以及5项结核抗体构成比。结果结论：1.通过PCR得到了结核分枝杆菌抗原Rv0685正确的基因片段；成功构建了重组表达质粒pQE80-Rv0685,确定了诱导表达的最适条件,得到了分子量约为45 kD的Rv0685蛋白,具有一定的特异性,蛋白芯片结果尚在考察之中。2.结核杆菌抗体检测蛋白芯片的敏感性为90.8%（118／130）,特异性为90%（45／50）,LAM的检出率最高为91.5%。用ESAT6、CFP10、M16和M38及LAM抗原制备的结核杆菌抗体检测蛋白芯片对结核病进行联合诊断,其敏感性和特异性较高,可用于结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片试剂盒的研制。
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