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生物素—蛋白连接酶(BirA 酶)的基因克隆、原核表达和活性鉴定

论文摘要

由于BirA酶生物素化的能力,其作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究,特别是细胞表面受体-配体相互作用的研究。本研究目的:构建生物素-蛋白连接酶（BirA酶）基因的表达载体,并在大肠杆菌BL21 （DE3）中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pET32a中构建BirA酶-Trx融合蛋白基因的重组表达载体pET32a–BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,通过SDS-PAGE电泳初步检测,筛选高表达菌株。对高表达菌株进行发酵罐高密度发酵表达,表达产物采用金属螯和柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽（BirA substrate peptide,BSP）的VR111-BSP蛋白为底物,用ELISA鉴定表达产物的生物素化活性,并研究了BirA酶生物学活性。结果:构建了pET32a–BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21 （DE3）中诱导表达分子量为51779的BirA酶-Trx融合蛋白。表达菌株在30升发酵罐上建立了高密度发酵工艺,发酵密度达到了80 g湿菌体/L发酵液,BirA酶表达量为2.62×107 U/g湿菌体。表达产物经金属螯和柱纯化后,得到N端带有Trx标签的BirA酶蛋白,纯度大于90%。EL ISA的结果显示,表达产物能使底物VR111-BSP蛋白生物素化。并得到了BirA酶的米氏常数Km（19.4μM/min）和最大反应速度Vmax（0.68μM/min）。结论:成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,与商业化产品相比具有低成本、高比活的优点。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 综述
  • 1.1 BirA 酶的简介
  • 1.2 大肠杆菌表达系统研究现状
  • 1.3 本课题来源和研究内容
  • 第二章 BirA 酶基因表达载体的构建、原核表达
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与仪器
  • 2.3 方法
  • 2.4 结果与分析
  • 2.5 总结与讨论
  • 第三章 BirA 酶发酵工艺研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与仪器
  • 3.3 方法
  • 3.4 结果与分析
  • 3.5 总结与讨论
  • 第四章 BirA 酶纯化工艺的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与仪器
  • 4.3 方法
  • 4.4 结果与分析
  • 4.5 总结与讨论
  • 第五章 BirA 酶的活性鉴定与研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与仪器
  • 5.3 方法
  • 5.4 结果与分析
  • 5.5 总结与讨论
  • 第六章 总结与展望
  • 6.1 主要结论
  • 6.2 存在问题与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士期间发表的学术论文
  • 上海交通大学博士学位论文答辩决议书

    • 相关论文文献

    本文来源: https://www.lw50.cn/article/7c705a1ea2a5ebd7892ce005.html