Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

论文摘要

【目的】制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）的标准品。【方法】提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制做和实时荧光定量PCR。【结果】重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT-Satb2基因已成功克隆。【结论】所构建的pGMT-Satb2基因荧光定量PCR检测标准品应用TagMan荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。

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ABSTRACT

第1章前言

第2章技术路线

第3章材料与方法

3.1 材料

3.1.1 主要实验设备

3.1.2 实验动物

3.1.3 主要试剂

3.1.4 常用实验试剂的配制

3.2 方法

3.2.1 组织中 RNA 的提取

3.2.2 RNA 浓度检测及定量

3.2.3 第一链cDNA 的合成

3.2.4 引物设计与合成

3.2.5 Satb2 质粒标准品的构建

3.2.6 制作标准曲线

第4章结果

4.1 RNA 质量鉴定

4.2 PCR 结果

4.3 酶切结果

4.4 测序结果

4.5 标准曲线

第5章讨论

5.1 Satb2 基因

5.2 引物设计

5.2.1 引物的特异性

5.2.2 长度

5.2.3 G+C 含量

5.2.4 引物3'端的末位碱基

5.2.5 模板内与引物相似性较高序列

5.2.6 Tm 值

5.2.7 发夹结构

5.2.8 二聚体

5.3 RNA 抽提

5.3.1 减少 RNA 酶污染

5.3.2 减少杂质污染

5.3.3 RNA 质量的检测

5.4 质粒构建

5.4.1 关于质粒

5.4.2 质粒抽提

5.4.3 质粒的鉴定

5.5 实时定量 PCR 标准品的制备

第6章结论

第7章参考文献

致谢

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