本研究分别采用Pcagg-HA重组质粒、含禽流感H5亚型HA基因的VSV重组病毒和新-禽二联疫苗作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用纯化的高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1亚型A/Duck/Zhejiang/11/00（H5N1）（DZJ/1100）毒株包被ELISA方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得九株H5亚型HA特异性单克隆抗体（McAb）,分别命名为10E2B1、16C11A12、16C11B1、14B5H9、11C7H8、9E1A1、14B4B12、15A9H11和12G1B1。各株McAb腹水效价测定显示九株HA特异性McAb效价均大于5000。抗体亚类检测结果表明九株HA特异性McAbs亚类依次为IgG3、IgG3、IgG3、IgM、IgM、IgM、IgM、IgM和IgG2b,所有McAb均为κ链,经检测具有良好的特异性。采用纯化的高致病性禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00（H5N1）毒株包被ELISA方法, H5亚型特异性单克隆抗体为检测抗体,建立了检测H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:纯化病毒1:1250倍稀释,单抗1:500稀释,酶标抗体为1:5000倍稀释,一抗、单抗及酶标抗体反应时间均为1.0h。用建立的竞争ELISA方法对已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽类及猪病阳性血清以及其他15个HA亚型禽流感标准病毒株血清进行交叉反应性试验,结果表明:建立的H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA方法和其他禽及猪类血清以及其他亚型禽流感标准阳性血清均没有明显的交叉反应性,与阴性对照没有明显差异,说明该方法对H5亚型禽流感病毒抗体具有良好的特异性。
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