α-N-乙酰半乳糖胺酶是血型转换的工具酶,可以降解A型红细胞表面抗原、消除其抗原抗体反应,在输血治疗中,可以避免血型配型带来的不便。本实验室从报道的α-N-乙酰半乳糖胺酶中选取活性最好的酶,构建α-N-乙酰半乳糖胺酶的原核表达载体,表达并纯化α-N-乙酰半乳糖胺酶,检测酶活性。利用定点突变技术,在关键位点进行突变,用高通量筛选技术筛选突变文库,期望得到较高活性的α-N-乙酰半乳糖胺酶。本课题的研究工作主要包括以下两部分：1.α-N-乙酰半乳糖胺酶的构建为了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的筛选、检测方法,我们提取脑膜金黄杆菌的基因组DNA,以此为模板PCR扩增出α-N-乙酰半乳糖胺酶（A4）。将A4克隆至pET-24a载体,转化B121表达菌株进行蛋白表达。使用亲和层析方法纯化His-A4酶,选择显色底物验证酶活性。同时,我们改进了传统的ELISA方法,直接将红细胞膜包被于ELISA检测平板中,以红细胞膜表面抗原作为直接底物,用ELISA方法检测酶活性。此研究建立了新型ELISA实验方法,以此方法验证了A4酶的活性,证明了此酶能够有效降低红细胞表面抗原抗体反应,且具有浓度和时间依赖性。2.α-N-乙酰半乳糖胺酶突变文库的筛选自然界中的α-N-乙酰半乳糖胺酶活性较低,不足以大规模生产酶用于通用型血的制备。在本实验中,使用定点突变技术结合高通量筛选方法,期望得到活性较高的糖苷酶。我们突变了酶的6个氨基酸位点分别是96、98、179、181、225、228,筛选了2400个左右的重组子,从实验中可知,179、181、225、228位置突变后酶的活性大幅度下降,因此这四个位点对酶的活性至关重要。96、98这两个位点突变后,有4个突变酶活性相当,它们突变后活性改变的机理需要进一步研究。
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