随着个性化医疗的发展,临床已经迫切需要建立既快速又准确的方法来检测样本中核酸序列的变化。理想的检测方法需要满足以下几点：敏感--能在大量的间质细胞和正常细胞的背景下检测到微小的变化；简单实用--能在临床实验室顺利实施；快速---及时为临床诊疗提供重要的治疗信息；以及成本低廉。高分辨率熔解曲线法（HRM）是一项近年来发展起来用于检测核酸序列变异的技术,它可以最大程度的满足上述临床需求。本文旨在建立一项以HRM技术为基础的方法来检测组织或血浆DNA中KRAS基因12、13密码子的突变。本文首先使用饱和荧光染料建立了三种HRM检测体系检测.KRAS基因第二外显子12、13密码子的突变,并使用已知KRAS突变的细胞株进行灵敏度评价：①传统PCR-HRM体系：产物片段长度为163bp和59bp的体系分别能最低检测到10%和3%的突变细胞；②非标记探针-HRM体系：最低检测到3%的突变细胞；③COLD-PCR结合非标记探针-HRM体系：最低检测到0.1%的突变细胞。结果显示：所建立的三种高分辨熔解曲线分析体系均优于“金标准”Sanger测序。采用非标记探针-HRM体系检测43例胰腺癌患者组织DNA KRAS基因12、13密码子的突变,结果显示：检测到20例KRAS.基因突变（阳性率46.5%）,Sanger测序法只检出其中13例存在KRAS基因突变（阳性率30.2%）。随后采用目的DNA克隆测序方法对上述两种方法检测结果不一致的7例标本进行验证,结果均与非标记探针-HRM体系一致。结果表明非标记探针-HRM体系检测KRA.S基因12、13密码子的突变的准确性和敏感性均较好。采用COLD-PCR结合非标记探针-HRM体系检测36例胰腺癌患者、23例疾病对照组患者和24例表面健康人的血浆游离DNA KRAS（?）基因12、13密码子的突变,结果显示：36例胰腺癌患者血浆中检测到26例KRAS基因突变（阳性率72.2%）,疾病对照组和表面健康人群中均未检测到KRAS基因突变；对胰腺癌诊断的敏感性、特异性和准确性分别80.6%,87.5%和83.3%,ROC分析曲线下面积（AUC）为0.861。我们建立的COLD-PCR结合非标记探针-HRM检测血浆游离DNA KRAS基因12、13密码子突变的方法是非侵袭性、方便且敏感的体系,能为临床提供胰腺癌的诊断信息。
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