目的:通过体外培养兔角膜缘干细胞,观察其生物学特性,建立兔角膜缘干细胞的体外培养方法。探讨生长因子(EGF、bFGF、NGF)对兔角膜缘干细胞的增殖作用影响及最佳有效浓度。方法:0.25%胰蛋白酶消化角膜缘组织,用含15%胎牛血清的DMEM:F12(1:1)(W/W)的培养液(DF)对兔角膜缘干细胞进行体外培养,形态学观察,培养的细胞早期使用AE1/AE3(针对一组酸性和碱性角蛋白的抗体)、晚期使用AE5(对64KD角蛋白特异的单克隆抗体)作细胞免疫化学鉴定。取第2代生长状态良好的干细胞,以5×103个ml细胞浓度接种于96孔细胞培养板中,依次加入不同浓度的EGF、bFGF及NGF培养48h后,采用MTT法测定细胞增殖情况。结果:原代培养细胞48h后开始贴壁,部分细胞由圆形变为卵圆形或长梭形;10～14d形成单层,细胞呈圆形、卵圆形,类角膜上皮细胞;细胞传到第5代左右开始出现老化状态;免疫细胞化学染色:培养的细胞早期AE1/AE3呈阳性而少部分细胞AE5呈阳性,培养的细胞晚期AE5呈阳性。EGF浓度为10ng/ml、bFGF浓度为20ng/ml及NGF浓度为100ng/ml时对兔角膜缘干细胞的促增殖作用最佳(P<0.01)。结论:通过本文的实验方法,建立了兔角膜缘干细胞的体外培养方法。EGF、bFGF及NGF可有效促进兔角膜缘干细胞的生长,培养的适宜浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml。
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