高迁移率族蛋白B1单克隆抗体的制备及其在竞争ELISA中的应用

论文摘要

目的制备HMGB1单克隆抗体并建立HMGB1的竞争ELISA测定方法。方法用bis（sulfosuccinimidyl）suberate制备HMGB1-BSA偶联物（HMGB1-BSA）和HRP标记的HMGB1（HMGB1-HRP）；以完全佐剂乳化的HMGB1-BSA免疫Balb／c小鼠；用50％PEG使小鼠脾细胞与Sp2／0细胞融合；用有限稀释法克隆杂交瘤细胞；用DE52离子交换色层析柱纯化单克隆抗体；用静脉注射链尿菌素法建立大鼠糖尿病模型。结果在120个孔内，发现17个孔内有分泌HMGB1单克隆抗体的杂交瘤细胞生长。对其中A6-Ⅲ孔内杂交瘤细胞用有限稀释法克隆化，共获得7株分泌HMGB1特异性抗体的杂交瘤细胞株。用其中一株杂交瘤（HMGB1-C1株）制备了纯化HMGB1单克隆抗体。利用HMGB1-BSA和HMGB1-HRP建立的竞争ELISA的测定范围为1～320ng／mL，回收率为97～106％，变异系数为2.6～7.3％。用该竞争ELISA测定正常和糖尿病大鼠血清HMGB1水平发现糖尿病大鼠血清HMGB1水平显著高于正常大鼠。结论以HMGB1单克隆抗体建立的竞争ELISA有望成为一种具有灵敏度高、特异性强，重复性好，操作简便和快速的测定方法。

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引言

第一部分小鼠的免疫

（一） HMGB1的修饰

（二）免疫方法

（三）小鼠血清抗HMGB1-BSA抗体的测定

（四）结果

（五）小结

（六）附表

第二部分 HMGB1单克隆抗体的制备—细胞融合

（一）细胞融合

（二）上清液HMGB1抗体活性的测定

+杂交瘤细胞的克隆化（A6-III）'>（三） HMGB1⁺杂交瘤细胞的克隆化（A6-III）

（四）小结

第三部分 HMGB1单克隆抗体的纯化

（一）腹水的制备

（二）腹水抗体效价及特异性的测定

（三）抗体的纯化

（四）结果

（五）小结

第四部分 HMBGI竞争ELIAS

（一） HMGB1竞争ELISA基本技术路线

（二） HMGB1单克隆抗体包被浓度及HMGB1-HRP结合物稀释度

（三） HMGB1竞争ELISA的测定范围

（四） HMGB1竞争ELISA的回收率和变异系数

第五部分糖尿病大鼠血清HMGB1的测定

（一）材料

（二）方法

（三）结果

（四）小结

（五）附表

第六部分讨论

第七部分参考文献

第八部分 HMGB1的免疫学研究进展（综述）

致谢

附录一所用试剂配制

附录二英文缩略词对照表

附录三本研究论文发表影印件

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