第一部分:替莫唑胺诱导的脑胶质瘤耐药细胞系U251/TR的建立目的脑胶质瘤单纯手术难以根治,作为新一代化疗药替莫唑胺（TMZ）有良好的抗胶质瘤活性,但新近临床研究表明,耐药性的产生限制了TMZ药物的化疗效果,成为胶质瘤化疗失败的主要原因,因此在体外建立对TMZ耐药的胶质瘤细胞系,对于探讨逆转胶质瘤耐药的有效方式以及提高胶质瘤的化疗效果有重大意义。方法首先利用RT-PCR检测U251细胞中MGMTmRNA的基础表达水平作为进一步实验的依据。采用体外分步诱导法使U251细胞对TMZ产生耐药性;采用细胞集落法确定U251/TR的耐药性;MTT法检测TMZ对U251/TR细胞毒作用,由回归方程求出半数抑制浓度,进而得出U251/TR的耐药指数;最后用RT-PCR检测U251/TR细胞MGMTmRNA的表达;分析研究U251/TR细胞和U251细胞的耐药关系。结果RT-PCR检测在U251细胞中未检测到MGMT mRNA的表达;模拟临床替莫唑胺的用药程序,通过体外分步诱导法成功地建立了对TMZ具有稳定耐药性的U251/TR细胞系。在20.61～164.86mM TMZ培养液中,细胞集落形成相对率显示,U251/TR-6细胞形成相对率是未诱导组U251细胞的4～11倍; MTT法检测显示,U251/TR对TMZ的耐药指数显示出约4倍的耐药;RT-PCR检测显示,U251/TR细胞MGMTmRNA表达上调,并可扩增出571bp的特异性片段。结论成功建立了一株由TMZ诱导的人脑胶质瘤耐药细胞系U251/TR,分阶段适度递增化疗药物浓度是U251细胞顺利产生相对耐药性的重要环节;MGMT基因表达上调在U251细胞获得性耐药机制中起重要作用。第二部分:MGMT抑制剂O6-BG对于脑胶质瘤细胞耐药性的研究目的替莫唑胺是治疗脑胶质瘤最有效的药物之一,但抗药性的产生限制了临床效果。研究表明DNA修复蛋白MGMT是肿瘤细胞对TMZ等烷化剂耐药的主要分子机制。本实验拟通过MGMT酶抑制剂O6-BG联合TMZ用药,探索提高TMZ对胶质瘤化疗效果的新途径。方法采用我们成功建立的由TMZ诱导的人脑胶质瘤耐药细胞系U251/TR及其亲本细胞U251,实验分成四组:1):空白对照组;2):O6-BG组;3):TMZ组;4)O6-BG+TMZ组;采用MTT法测定各细胞组对TMZ的细胞毒实验作用影响。结果O6-BG能使TMZ对U251/TR细胞敏感性提高3.1倍,而对U251细胞无增敏作用,10μM O6-BG预处理2小时即能明显抑制MGMT活性, 50μM以上时能完全抑制MGMT活性。O6-BG毒性极低,50μM时细胞生存率高于95%。结论O6-BG通过抑制耐药细胞内MGMT的活性,能逆转U251/TR对TMZ的耐药性,可望作为化疗增敏剂与TMZ联合使用。
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