乳铁蛋白（Lactoferrin, LF ）是一种天然活性铁结合糖蛋白,广泛存在于动物的乳汁、血液、泪液、唾液、汗液、精液、羊水、胰液、胆汁、小肠液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。其中在乳中的含量最为丰富,特别是在初乳中浓度最高。LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质,它不仅参与铁的转运,而且具有抗微生物、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能。为了深入的了解小型猪乳铁蛋白N叶基因的生物学活性和应用发展空间,为该蛋白的以后研究提供基础,进行了本实验。本实验进行了猪乳铁蛋白的克隆与表达研究,详细内容如下:试验1:猪乳铁蛋白N叶基因的克隆与序列分析本研究采用外科手术取得泌乳15 d的小型母猪乳腺组织5 g,通过Trizol提取其中的RNA,并通过反转录方法得到PLF N叶的cDNA,以GenBank上登录的L77887序列为参考设计了一对引物进行PCR得到了猪乳铁蛋白的N-端基因（PLF-N）。克隆得到的基因长度为1099bp,包含了PLF上1077个编码序列。在1094-1096处设计引物时突变为TAA终止密码子,因此,此开放阅读框翻译后的蛋白包含了359个氨基酸残基。将此基因克隆入pMD19-T-simple载体,并进行测序。测序结果与GenBank上登录的序列号为AY306198、EF012241、L77887、M81327、M92089的猪乳铁蛋白进行比对,发现本研究中所克隆的PLF-N基因序列与其它基因报道基因同源性高达99%,确为猪乳铁蛋白基因。试验2:猪乳铁蛋白N叶基因的大肠杆菌表达将连接有测序正确目的DNA片断的pMD19TS-PLF-N质粒用EcoRⅤ/EcoRⅠ双酶切后所得的带有EcoRⅤ、EcoRⅠ酶切末端的目的基因片断与用EcoRⅤ/EcoRⅠ双酶切pET-30a（+）原核表达载体后所得载体大片断用T4酶进行连接并转化到DH5α感受态细胞,通过酶切鉴定目的基因与载体的连接正确。将重组体转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后,得到了目的基因的融合表达。分析结果表明,猪乳铁蛋白得到特异性表达。通过对诱导剂IPTG浓度的改变和诱导时间的长短进行摸索,得到重组菌体
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