本课题采用体外构建的B7shRNA质粒载体修饰骨髓来源树突状细胞,通过抑制其CD80、CD86表达以阻断B7/CD28协同刺激通路,从中探讨诱导T淋巴细胞无能的机理;研究经RNAi敲减CD80、CD86后的供体来源树突状细胞在异体心脏移植中对移植物的保护作用及其抗排斥机制。 第一部分 B7shRNA质粒载体构建及其阻断共刺激通路作用体外研究 目的:构建针对小鼠树突状细胞（dendritic cell,DC）表面B7分子的短发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）质粒载体,探讨其对阻断B7/CD28共刺激通路及诱导异系T淋巴细胞无能的作用。方法:体外培养小鼠骨髓源DC;分别构建针对B7-1（CD80）、B7-2（CD86）的shRNA质粒载体pCD80shRNA、pCD861shRNA、pCD862shRNA,分别转染DC,以流式细胞术初步检测对DC表面抗原CD80、CD86表达的影响;以pCD80shRNA和pCD862shRNA共同构建同时针对CD80、CD86的pB7shRNA质粒载体,转染DC,荧光实时定量PCR及流式细胞术检测转染前后CD80、CD86mRNA及DC表面抗原CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ表达,混合淋巴细胞培养观察pB7shRNA转染DC对刺激异系T淋巴细胞增殖能力的影响,荧光实时定量PCR测定混合淋巴细胞培养体系中IL-2mRNA表达水平。结果:pCD80shRNA转染DC,使CD80抗原表达由93.42%下降至31.05%,pCD861shRNA、pCD862shRNA,分别转染DC,使CD86抗原表达由78.70%下降至44.26%、37.90%;以pCD80shRNA和pCD862shRNA成功构建针对CD80、CD86的pB7shRNA质粒载体;B7shRNA干扰DC对CD80、
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