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人Endostatin基因的克隆及其在hela细胞中的表达

论文摘要

人内皮抑素（Endostatin）是第一个进入临床研究的内源性血管生成抑制剂,是胶原蛋白ⅩⅧC末端非胶原区NCl结构域的20KDa的片段。它可以抑制内皮细胞的增殖和转移,从而降低肿瘤内血管生成,阻断营养通路,达到杀死肿瘤细胞的目的。其最大的优点为无毒性和无抗药性。本文利用反转录PCR克隆人Endostatin基因,分别构建到分离表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1中,然后把两个重组表达载体利用脂质体介导法分别转染真核细胞hela,48小时后可在荧光显微镜下观察到被转染细胞发出的绿色荧光,传代10次后,绿色荧光仍持续表达,说明是稳定转染。并且,利用兔抗人Endostatin抗体对已转染的细胞作免疫细胞化学分析,DAB显色后,在显微镜下观察,结果显示,转染的细胞显棕红色,没有转染的细胞不显色。这说明,Endostatin在转染的细胞内稳定遗传与表达。从而为基因药物和基因治疗的研究奠定了基础。

论文目录

  • 引言
  • 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 试剂
  • 1.2 细胞及菌种
  • 1.3 质粒
  • 1.4 常用溶液的配置
  • 2 方法
  • 2.1 人 Endostatin基因的克隆
  • 2.2 pEGFP-C1-en的构建及检测
  • 2.3 pIRES2-EGFP-en的构建及检测
  • 2.4 hela细胞的活化，培养及冷冻保存
  • 2.5 重组子的提取
  • 2.6 脂质体法转染
  • 2.7 转染细胞总DNA的提取
  • 2.8 转染细胞总DNA的PCR检测
  • 2.9 免疫细胞化学检测
  • 结果与分析
  • 1 人 Endostatln克隆的检测
  • 2 pEGFP-C1-en的检测
  • 3 pIRES2-EGFP-en的检测
  • 4 脂质体转染后细胞的荧光观察
  • 5 转染细胞总DNA的PCR检测
  • 6 免疫细胞化学的检测
  • 讨论
  • 参考文献
  • 文献综述
  • 致谢
  • 硕士期间发表论文情况

    • 相关论文文献

    本文来源: https://www.lw50.cn/article/b22019f1ae4fc428efb90c1a.html