目的:构建含有梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）外膜蛋白Tp 0319的优势表位区的原核表达载体pQE32/ Tp0319,并在E.coli M15中诱导表达目的蛋白,纯化表达产物并对其进行免疫原性和免疫反应性分析,为探索Tp 0319重组蛋白在临床梅毒血清学诊断中的应用价值和其免疫活性提供实验依据。方法:通过生物信息学分析,挑选Tp0319基因优势抗原表位,以Tp Nichols株基因组DNA为模板,高保真聚合酶链反应扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pQE32中构建重组质粒pQE32/ Tp0319,然后将其转化至表达宿主菌E.coli M15中进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot进行分析和鉴定表达产物;Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行稀释透析复性, BCA法测定纯化蛋白浓度。用纯化、复性的Tp0319重组蛋白包被微孔板,建立间接ELISA方法,检测梅毒参比血清和临床梅毒患者血清,同时与TPPA法进行比较,根据重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况,评价重组抗原在梅毒血清学诊断中的应用价值。同时用纯化的Tp0319重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA方法检测免疫兔血清中Tp0319多克隆抗体的效价,对Tp0319重组蛋白的免疫原性进行分析。结果:软件分析Tp0319基因的抗原表位选择了Tp0319基因的116-939bp位碱基序列为目的表位（片段长度为824bp,编码274个氨基酸）;PCR扩增得到大小约为824bp的目的片段;构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片段为Tp0319目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组工程菌表达了一相对分子量（Mr）约为30kDa的目的蛋白条带,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA亲和纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白;Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性反应;以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测梅毒参考血清,其阴阳性符合率均为100%;对TPPA法检测的150份阴阳性血清进行检测,与TPPA法比较ELISA法的灵敏度为90.7%,特异度为100%,ELISA法与TPPA法符合率为95.3%;利用纯化复性的Tp0319重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价在1:10 240以上。结论:1、成功构建了pQE32/ Tp0319原核表达体,将其转化至E.coli M15后表达出了一相对分子量（Mr）约30kDa的重组蛋白;2、Tp0319重组蛋白具有良好的免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体;3、Tp0319重组蛋白具有较好的免疫反应性,能与梅毒阳性血清特异性结合,有望应用于梅毒血清学诊断。
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